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无需建库,直接测序的测序新技术

2012.12.12

  来自英国老牌测序研究机构Sanger研究院,以及英国剑桥巴布拉汉研究所的研究人员发表了题为“Direct sequencing of small genomes on the Pacific Biosciences RS without library preparation”的文章,首次研发出了一种无需文库制备,就能完成DNA单分子测序的新技术,这一技术是在第三代单分子测序系统PacBio RS上完成的,不仅能简化了基因组测序的标准流程,而且也降低了所需样品DNA的数量。相关成果公布在12月的Biotechniques上。

  需要建库的测序技术

  一般来说,基因组测序(具体来说,指的是第一代和第二代测序方法)的实验步骤主要包括以下几点:

  在此流程中应该说文库构建或者称序列收集最为费时费力,并且由于建库的过程中样本被扩增上千倍,因此样本中基因量的线性关系就会出现偏差,NGS定量受到影响,所以说如果能无需这部分步骤,将能大大提升基因组测序的速度和精确性。

  无需建库的测序新技术

  这一新技术无需进行文库制备,可直接从DNA片段获得测序数据,并且与传统标准方法相比,所需的DNA量也相当少,用量可低至不到1ng(10亿分之一克),仅为常规测序方法的500分之一到600分之一。研究人员指出,这种方法适合用于小基因组测序。

  文章的第一作者是Sanger研究院的Paul Coupland博士,他表示,“这是首次实现了DNA单分子的直接测序”,“我们利用这种新方法,完成了病毒和细菌的基因组测序,发现即使是没花大力气进行条件优化,我们也能鉴定出是何种生物,并且就算这些生物体内带有一些特殊的基因或质粒(决定抗生素耐药性),或者譬如特殊DNA碱基修饰之类的遗传信息,都不会影响基因组测序。”

  “这项技术通过优化,将能快速、高效地识别医院和其他医疗场所中的细菌和病毒,具有很大的应用潜力。而且这也将能提升序列的可信度,因为这一过程无需构建文库。”

  研究人员在第三代单分子测序系统PacBio RS上演示了这种简化的直接测序方法,这种测序方案被称为SMRT,也就是单分子实时DNA测序技术,这种技术的一个显著特点在于从样本制备到获得测序结果,所需的时间还不到一天,因此十分适合用于传染病监控。

  在这项研究中,研究人员利用极少量的DNA样品,分析了环形小分子单链,以及双链DNA病毒基因组,以及金黄色葡萄球菌的MRAS菌株中的一种线性片段。这些样品量只有800pg,比标准分析中所需的少了600倍。通过PacBio,研究人员虽然只完成70个片段――这相对于常规测序方法来说,不过是很小的一部分,但这些信息足以让确定这些样品是何种生物了。

  这一方法是Sanger研究院这一平台上开发出来的,可以针对未知序列进行检查,因此可用于识别之前无法识别的生物种类,而且这种方法耗时少,样品需要量也少,是未来传染病监控,以及临床检查的一种有力手段。

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