【求助】关于梯度PCR问题

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• iii_ii (2014-4-21 16:31:26)

  今天做标本结果如下，阳性的还是阳性，最后第2条是阳性对照，最后1条是阴性对照。
  问题：我根据梯度PCR选择的50度做为退火温度，为何还是出现细的条带？
  是否需要选择更低的退火温度？减少cycles？

  
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• iii_ii (2014-4-21 16:32:51)

  原始protocol是 94C 2 min， 94 C 30 sec， 58C 1min， 72C 1min， 36cycles； 72C 7min， 4C hold。跑出的条带和我用50C退火温度跑出的条带基本一样，阳性对照很量，但是阴性的都有一条细线。
  我做梯度PCR以58为中心，其他条件没变，在53.5 和56.1的温度时对照出现细条，所以最后选择了50度做最佳退火温度，是否正确？

• iii_ii (2014-4-21 16:33:13)

  今天用48度的退火温度，30cycles再做了一次，最后一条是阳性对照，前面样本还是有3条出现了细条，不知道原因，大家请帮助分析一下。

  
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• iii_ii (2014-4-21 16:36:09)

  今天做了southern blot 电泳，目的条带大概是700bp。marker用的是1kb。
  不明白胶照相显示上半部分背景很亮，目的条带都没看见，下半部分看起来酶消化应该还可以。这种情况是啥原因？目的条带有没有可能处于上半部分，未显示？
  图片如下：
  ......

  
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• iii_ii (2014-4-21 16:36:27)

  Southern 的电泳？不是把基因组DNA酶切吗？不知道你的酶切是怎么设计的，是不是正好把目的基因的700bp条带切出来？
  1Kb marker 是哪个公司的？TAKARA的跟你的好像不太相符。
  能指出每个条带代表的分子量吗？
  样品中很亮的条带不是你的目的条带吗？
  你再给些具体信息吧
  

• iii_ii (2014-4-21 16:36:48)

  感觉没700bp呢
  说哈实验背景撒

• iii_ii (2014-4-21 16:37:12)

  mouse tail DNA 10 ul ，用 Eco RI 1.5ul 在37度消化2小时以后，再加 Eco RI 1ul 过夜消化。
  1％agarose ＋ 7.5 ul EB 跑胶， marker是1kb的ladder，电压115，时间2.5小时
  希望的目的条带是700bp。
  目的条带应该在上半部分，但是上半部分背景很亮，没看到。
  下面很亮的不是我要的目的条带，而且第3、4、5、14、15、17条最后有滴状高信号的是啥呀？
  

• iii_ii (2014-4-21 16:37:33)

  1kb的marker是1－10kb共10条带吧？但目的条带700bp怎么应该在上半部分？是不是100bp的marker哦？
  电泳时间太长。
  胶好像也有问题，是不是电泳前有点干了？
  mouse tail DNA 进行了 Eco RI 酶切位点分析没有。 Eco RI 很好切的，加的多了，而且时间长了。感觉是切碎了。
  

• iii_ii (2014-4-21 16:37:56)

  700 bp相对于整个gDNA来说，占的比例太少了！如果是这样，load的量要相当大才能看到，而且背景应该是相当高。高频酶切出来是弥散的带，不知道EcorI切割的频率有多高。
  同位素的检测灵敏度很高，所以即使看不到带也可以检测出来。
  如果实在想看，我觉得至少要将很亮的非目的区域的带切掉。前面的带是不是RNA？因为我认为EcorI切了后应该不可能有大量分子量相当的DNA片段才对，毕竟不是质粒啊，whole genomic DNA。
  没做过southern，班门弄斧，权当参考
  ......

• iii_ii (2014-4-21 16:38:16)

  Shilly JJ做的是souther blot 的第一步，就是普通的琼脂糖凝胶电泳。
  给我的第一感觉是下面的那一排条带就是你的目的条带，EcoRI 过夜酶切效率在75%以上。Shilly JJ还是把marker的图谱说说看，或者说那个公司的也行，确认一下下。
  你怎么知道目的条带应该在上面？如果用的是1kb的marker的话，那么700bp肯定是处于下面的。
  水滴状特别亮的地方应该是amberly哥哥提到的RNA。至于整个胶的上面一大片亮亮的区域，我觉得应该是这样的。因为溴化乙锭（EB）与DNA结合後，通过紫外线激发可观察被分离DNA片段的位置，所以，有没有可能是你在loading胶的时候上样过快或者过多导致样品溢出产生的。
  ......

• iii_ii (2014-4-21 16:38:38)

  1。建议：把没有经过酶切的DNA也跑一个孔，为对照，这样知道你的DNA质量如何
  2。TAKATA的1kb的 Ladder每条带分别是10000，8000，6000，5000，4000，3000，2000，1000。其中4000的是其他量度的3倍，你的似乎最亮的是第6条带。不过不管怎么说，对于1kb的Marker来说，700，绝对是在下面的。
  3。基因组DNA用EcoR1来切，不管你的目的条带是在什么位置（是不是正好目的基因两端有两个酶切位点），都会切成一大片Smear，是看不出来你的目的片段的，要做Southern后才能检的出来。
  4。同意上面几位所说，小分子量的那些可能是RNA，所以，我说要跑一个没有经过酶切的DNA作对照。
  ......

• iii_ii (2014-4-21 16:38:59)

  忘了说，你用的EcoR1 是专门切基因组的浓缩酶吧？还有，你说的DNA的量，用的是ul，而不是ug。印象里一般是用10ug去作酶切，不知道你的DNA浓度是多少？要是有10ug，如果用普通浓度的EcoR1 ，才1.5ul，肯定且不动。

• iii_ii (2014-4-21 16:39:19)

  今天还是做了杂交，明天就出结果了，到时候给大家回报。
  我的DNA是mouse tail 提取以后，加TE 60 ul 保存，取其中10 ul 进行消化的，具体浓度和量，我也不是很清楚。我刚开始学这些，边看书，边做的。
  大家多多指教
  ......

• iii_ii (2014-4-21 16:40:07)

  更正：我的目的条带是2.1kb、 3.5kb和8.0kb，marker是1kb的，是biolab的。
  今天照片出来没有目的基因条带。
  今天想了想，估计问题是DNA量少了，酶多了。
  准备下周增加DNA的量再做一次。
  大家看看是不是由于DNA量少，酶多的原因引起的问题？
  

• bring (2014-4-21 16:40:32)

  第一个问题：
  今天做标本结果如下，阳性的还是阳性，最后第2条是阳性对照，最后1条是阴性对照。
  问题：我根据梯度PCR选择的50度做为退火温度，为何还是出现细的条带？
  是否需要选择更低的退火温度？减少cycles？
  没有看懂，我看你上边说的，上边一排是阳性对照，下边是样本，那么这里的“最后第2条是阳性对照，最后1条是阴性对照。”是哪一排的？
  总原则上讲，阴性对照出现了条带，主要原因可能就是试剂出现了污染，可能是水，也有可能是dNTP等，我不清楚你说的阴性对照是什么，是不加模板的水吗？建议是换一套别人的体系。

• bring (2014-4-21 16:41:15)

  
  第二个问题：
  DNA抽提之后出要除去RNA，再用酚氯仿回收，有的试剂盒可以在抽提的时候加RNA酶去除RNA，你1Kmarker下边一大坨都是RNA。另外要测浓度，我感觉DNA的量不够，不然上边不会像白板一样，另外，酶切的酶体

• PINK (2014-4-21 16:42:12)

  第一个问题：
  ===========================================================================================================
  
  今天做标本结果如下，阳性的还是阳性，最后第2条是阳性对照，最后1条是阴性对照。
  问题：我根据梯度PCR选择的50度做为退火温度，为何还是出现细的条带？
  是否需要选择更低的退火温度？减少cycles？
  没有看懂，我看你上边说的，上边一排是阳性对照，下边是样本，那么这里的“最后第2条是阳性对照，最后1条是阴性对照。”是哪一排的？
  上边一排是阳性对照，下边是样本 是第一张梯度PCR，上面不同温度情况下，上一排是阳性对照，下一排是阴性标本对照。
  

• PINK (2014-4-21 16:43:46)

  
  我的第一个问题是：
  我做flipper的基因型鉴别，按照protocol做了以后，和阳性对照比较，阳性标本显示条带很清晰，但是其他标本，包括阴性标本在目的阳性条带位置也有一细线条带。考虑是退火温度问题。
  所以进行梯度PCR选择最适宜温度，就是我的第1张图显示，53.5和56.1度阴性标本同一区域还是有细条带，所以选择退火温度为50度和48度。
  结果显示细条带还是没有消除。

• bring (2014-4-21 16:44:10)

  我希望你把问题表述得更浅显一些，因为我不懂基因型鉴别是什么意思，搜索了一下，还是不太明白。你说的阴性标本不是空白对照，而是另外的标本，对吧？如果是这样，过低的退火温度是有可能导致非特异性条带的产生，如果是这样情况，应该是升高退火温度，而不是降低退火温度，既然56.1的温度还有条带，那么下次pcr的时候退火温度应该用58.8（就是你的第一张图）。另外，我觉得你的阴性标本的条带非常单一，所以我觉得是不是引物特异性出了问题，可以blast一下看看，是不是和相似片段的其他基因同源性比较高。我认为后者的原因比较大。

• yes4 (2014-4-21 16:44:39)

  今天做了southern blot 电泳，目的条带大概是700bp。marker用的是1kb。
  不明白胶照相显示上半部分背景很亮，目的条带都没看见，下半部分看起来酶消化应该还可以。这种情况是啥原因？
  
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  这个图上面一片糊我个人觉得不是DNA和RNA，应该是游离的EB
  主要原因是你跑胶的时间比较长，跑胶时DNA向正极泳动，EB向负极泳动，二者路过的就结合在一起，游离的EB就前往负极。
  这张图上部分分辨不出泳道，而且在负极处EB更亮，而且时间长几乎跑了整个胶的长度，导致EB在负极区堆积引起。
  个人觉得主要是这个原因，如果要确认，一个简单的判定方法：把EB加到样本里面，而不要在制胶时加到胶里面就可以明确。或者跑胶的时间短一点，把荧光调暗一点看看。