【求助】5重Taqman探针荧光定量PCR的发光基团和淬灭基团

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-8-05 11:19 作者: @STAR@ 来源: 分析测试百科网

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【求助】5重Taqman探针荧光定量PCR的发光基团和淬灭基团

大家好，如果想做5重Real-time PCR，关于发光基团和淬灭基团应该怎么选择？发光基团选5种不一样的，而淬灭基团选一样的可以吗？
我的实验是同时检测5种不同的菌。
另外，放在一个反应管内，荧光基团各自之间会有什么影响？对结果影响大吗？

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【求助】5重Taqman探针荧光定量PCR的发光基团和淬灭基团

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最新回复

www.1 (2015-8-05 11:19:25)

在同一管内做5重定量是需要勇气的！鼓励一下！
对于5通道的机器来说，你的发光基团就要与5个的滤光片对应，分别在这5个滤光片的波长范围内选择标记。淬灭基团主要是接收发射基团的光，所以波长通常要比发光基团长一些，也就是每个染料都有自己相对应的淬灭基团，明白这个之后，你说选5个一样的淬灭基团可以吗？
对于5重反应来说，各荧光基团之间有没有影响？一定会有的，只不过是大还是小的问题，这不仅取决于你选的染料波长，也取决于滤光片的带宽，但可以肯定的是染料选的恰当的话，对最终结果没有影响。
49888 (2015-8-05 11:19:48)

请教一下，你用的是什么荧光PCR仪器，我也要做多重荧光PCR。
ssonglikihi (2015-8-05 11:20:06)

可以参考下Smile＼
Dye    Quencher
FAM    BHQ-1/TAMRA
HEX/JOE/VIC/YY  　　　　BHQ-2
Texas Red/ROX BHQ-2
Cy5/Quasar670 BHQ-2 ( or -3)

37526714.snap.jpg
@STAR@ (2015-8-05 11:20:47)

QUOTE:
原帖由 49888 于 2015-8-5 11:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

请教一下，你用的是什么荧光PCR仪器，我也要做多重荧光PCR。
我们实验室的是ABI 7500的PCR仪。但不知道有效通道是几条。应该是5条吧。
@STAR@ (2015-8-05 11:21:04)

请教一下战友，你确定了荧光基团和淬灭基团了吗？
ssonglikihi (2015-8-05 11:21:27)

我用的是罗氏的lightcycler.

我现在只用了一条探针摸条件，我的探针标记的是FAM和TRAMA。
079777chao (2015-8-05 11:21:49)

This will depend on the type of machine you are using. The most commonly used 5' reporter dye for Real-Time PCR is 6-FAM. This dye works in most RT-PCR machines. As to the quencher, FAM works equally well with the TAMRA dye (for FRET) and the Blackhole Quencher-1 or Iowa Black FQ.
The ABI Real-time PCR machines have filters for FAM, VIC/JOE, NED/TAMRA and ROX. This allows you to use a variety of combinations for multiplexing. These include JOE NHS, HEX, Cy3, TAMRA NHS and Texas Red. Information on the absorption and emission spectra of all dyes offered at IDT can be found at the following link by clicking on the details button of the modification you are interested in. cuturl('http://www.idtdna.com/Catalog/Modifications/Modifications.aspx?catid=3')
Additional information about multiplexing using the ABI machines can be found at the Applied Biosystems Website cuturl('http://home.appliedbiosystems.com.')
ldh (2015-8-05 11:22:20)

勇气可嘉！！！！
特发ABI7500检测光谱通道！

73664236.gif
@STAR@ (2015-8-05 11:23:35)

谢谢各位！师兄说不可能做出来，而且好像我们那个仪器只能用4个通道。我准备做3条。这3条要得到理想的结果师兄说都很难！唉，刚看一个月资料，什么也不会呢，惭愧惭愧！看来这个实验并不想我想象的那么容易。尽力而为吧！！
veiwu (2015-8-05 11:24:15)

哈哈，你如果4重做出来的话博士都可以毕业了阿。ABI7500虽然说有5个通道，但是rox要占一个，所以最多只能做4重。我正在做两重，大家一起加油
@STAR@ (2015-8-05 14:31:21)

Cy5  BHQ2
FAM  TAMRA
JOE  BHQ1
看了看7500 PCR仪（PCR反应里面必须加入ROX，好像消除本底信号，所以不可以用ROX）的检测限制，还有各个染料的吸收波长和发射波长，只能是上面三种组合，而且BHQ2和Cy5这一组还不是很理想。
DCS (2015-8-05 14:31:42)

ROX可以帮助校正误差，但也不是一定要用的。不过做五重定量的难度真的很高，有那个时间优化消耗的精力和财力，可能还不如单重做核算呢。。。
remonte (2015-8-05 14:32:13)

多重PCR的主要问题在于设计好的引物和探针。
推荐用BIO RAD 的Beacon Desinger 软件设计。
@STAR@ (2015-8-05 14:32:29)

已经改2重了。谢谢大家的关心！我感觉一起做效果也不好，量很不好摸，也有很多条件的限制，仪器型号、发光基团的选择等。有些时候，多了不一定是好事。
@STAR@ (2015-8-05 14:32:46)

QUOTE:
原帖由 veiwu 于 2015-8-5 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
哈哈，你如果4重做出来的话博士都可以毕业了阿。ABI7500虽然说有5个通道，但是rox要占一个，所以最多只能做4重。我正在做两重，大家一起加油
请问你的荧光集团和淬灭基团选择的是哪四种？
vcve (2015-8-05 14:33:03)

最近才发现，做多重荧光定量PCR的战友不少啊，大家有什么问题和好的经验希望能集中到这里讨论cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=10899989&sty=1&tpg=1&age=0')，谢啦！AmelieDXY战友您好，感觉你和我现在的想法基本差不多，都是想用这种方法检测几种菌，您在哪里，是北京吗？以后多交流！
yizhi (2015-8-05 14:33:23)

我也在做，不需要定量，只要能定性就可以的，但我们要做7重。
woshi (2015-8-05 14:33:40)

我做双荧光的，FAM,HEX的MGB探针。
toy (2015-8-05 14:33:58)

5重的真不好做，要有一定的水准，本人是主要负责各种探针合成和设计的，欢迎交流，qq:540050192,5重的具体选择根据您仪器的情况，一般为FAM-BHQ1，HEX/VIC-BHQ1，TAMRA-BHQ2，ROX-BHQ2，CY5-BHQ3，波长分别为521,550,576,602,670.TAMRA作为淬灭基团本底会高很多。
milkdog (2015-8-05 14:38:23)

我们实验室的是ABI 7500的PCR仪。但不知道有效通道是几条。应该是5条吧。

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有点困难