【求助】PCR操作过程中有哪些注意事项？

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• www.1 (2015-8-29 17:19:06)

  
  注意事项对会者来说不难，但是对新手来说应该还是挺多的，简单说几条：
  1：避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。
  2：引物设计要正确，选择可靠的生物公司合成引物，如果公司不好，给的引物会不出结果。据说上海生工不错。
  3：DNA提取要成功。
  4：引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量会抑制体系的反应。
  5：跑胶时注意区分开EB污染区和清洁区。
  6：吸取试剂前不必每次都混匀，离心是为了把粘在壁上和盖上的试剂离下来。不离也没关系，可以直接用枪头吸。
  但是配制的时候需要充分混匀，比如溶解引物，需要先混匀再分装。
  还有DNA提取之后最好4度过夜之后再做PCR，这有利于DNA的充分溶解。

• 铜雀 (2015-8-29 17:19:22)

  谢谢，很有用。还想问下，如果枪头上有残留打不出来会有影响吗？如何避免这个问题啊？

• 铜雀 (2015-8-29 17:19:45)

  还想问下，如果枪头上有残留打不出来会有影响吗？如何避免这个问题啊？
  如果枪头有残留，当然会影响结果。首先可以考虑换好一点的进口枪头。其次，可以在加样的时候将枪头恰好伸入PCR反应管的液面下一点，然后将液体缓缓打入液面下，至恰好打出一个小气泡为至。

• 铜雀 (2015-8-29 17:20:16)

  QUOTE:

  原帖由 铜雀 于 2015-8-29 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  还想问下，如果枪头上有残留打不出来会有影响吗？如何避免这个问题啊？
  如果枪头有残留，当然会影响结果。首先可以考虑换好一点的进口枪头。其次，可以在加样的时候将枪头恰好伸入PCR反应管的液面下一点，然后将液体缓缓打入液面 ...

  谢谢，估计换枪头是没有指望的，我试试看你后面教的方法吧！
  还想问下模板放4摄氏度冰箱可以放多久啊？

• 铜雀 (2015-8-29 17:20:57)

  
  如果配好的引物没有完全溶解，吸取稀释后会有影响吗？

• purrr (2015-8-29 17:21:54)

  
  是融化吗？可能会有影响，一定要融化后再吸取稀释

• www.1 (2015-8-29 17:23:42)

  QUOTE:

  原帖由 purrr 于 2015-8-29 17:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  是融化吗？可能会有影响，一定要融化后再吸取稀释

  我做过的许多次PCR中，不完全溶解是不影响结果的。
  不管是buffer还是taq还是引物，
  每次我都是看溶够了我用的量就开始吸。
  一来能有效保护产品的质量。
  二来节约时间。

• remonte (2015-8-29 17:26:19)

  
  没试过不完全溶解到底行不行，每次我都害怕结果不好而全溶。

• remonte (2015-8-29 17:27:50)

  
  用枪时候一定要按到底吗？我就不全是这样，比如加电泳样品的时候，全打出来反而把气泡也打出来了，只要刚好把样品全打进去即可。不同情况用枪习惯也不同，看情况而定。灵活。。。。。

• toy (2015-8-29 17:28:11)

  
  加样过程最好在冰块上操作。

• seagate (2015-8-29 18:24:00)

  
  PCR做了很多，根据论坛和自己的经验总结了一下几点，算是抛砖引玉吧，呵呵：
  1）PCR实验一定要保管好试剂，防止交叉污染，尤其是ddH2O2的交叉使用，极易引起污染（惨痛的教训）！
  2)NA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
  3)PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。
  4)超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
  5)PCR操作应戴手套并勤于更换。
  5)成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
  6)试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
  7)最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
  8)引物稀释时，要首先瞬时离心，以避免粉末状引物在开盖时弹出管外。
  9)实验设阳性、阴性对照。