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【转帖】MTT实验两年心得
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MTT实验心得
MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。
MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。
1、培养好细胞点板。
养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上cuturl('www.atcc.org')检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：
自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。
点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大！
2、点板布局。
其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。
3、加MTT。
如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。
4、加入MTT后的反应
时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我不多说，如果有人不明白我再证明给他看。当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。
5、检测MTT。
还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。
6、吸收值分析。
在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。
7、如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。
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最新回复
dog002 (2015-8-12 15:42:01)
楼主辛苦了
正准备做CCK-8实验，不知楼主是否知道哪个公司的CCK-8价格低些？多谢
tangxin_80 (2015-8-12 15:42:36)
96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法判断板里细胞的死活了.不知道有没有什么办法?
rfv (2015-8-12 15:43:12)
mtt需要在终止培养前一小时加入吗？
bring (2015-8-12 15:43:51)
我们一般是到实验设定的时间点后终止培养，加MTT，再继续培养4小时。
iii_ii (2015-8-12 15:44:07)
请问楼主,有什么做MTT实验的参考资料或者书之类的?可以系统的学习!
ero11 (2015-8-12 15:44:49)
请问楼主，你在做MTT实验室是否遇到过下面的情况：调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，并不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺大的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的大，如果把调零孔的值减掉之后，OD值为负值。另外加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红。对照组测出的OD值在0.4～0.5之间。接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm。
我做了很多次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象。我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的结果：三个浓度下的OD值两次的都比较吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右。不知是什么原因，请分析。
另外，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那么高吧，而且你复孔之间的差值一般是多少？
standup (2015-8-12 15:45:13)
1、MTT应该新鲜配制，在4度保存最多不能超过2周，也有说10天的，反正不能太久；
2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不能用的，应该加入无菌PBS。
3、如果有心，你可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析。
4、加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净。
这几点不知对你有用否。
standup (2015-8-12 15:45:40)
对于贴壁细胞：
死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好
对于悬浮细胞似乎不好直接判断
以上有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，然不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内就可以判断，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不易着色。
如果96-孔板养不好，可以试着用24孔板
如果是旧板养不好，就试着用新板。
为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3 h，但不要太长，否则板就黄了。
还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试。如果你的细胞不好养，尽量不要用旧板。
standup (2015-8-12 15:46:09)
standup (2015-8-12 15:46:27)
CCK-8这个化合物好像是日本人发明的，佩服日本人的敬业精神，这个化合物与MTT不一样（MTT检测是一次性的，测完后细胞就不存在了），检测过的细胞还是活的，换液后可以继续研究，这恐怕就是它的最大优势，当然要注意无菌操作。
xuuuu (2015-8-12 15:46:46)
我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，结果颜色就不对了，干扰了MTT的检测。
standup (2015-8-12 15:47:42)
ero11 (2015-8-12 15:48:08)
standup (2015-8-12 15:48:49)
qqq111 (2015-8-12 15:49:11)
楼主辛苦了，我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和 双波有何区别？
standup (2015-8-12 15:51:08)
下图A是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对于你的酶标仪建议使用470 nm.
24084663.jpg
standup (2015-8-12 15:51:31)
72831110.jpg
mickeylin (2015-8-12 15:52:51)
standup (2015-8-12 15:53:08)
yizhi (2015-8-12 15:53:36)
我一直在想一个问题，为什么网上见的protocol绝大部分都是MTT加10～20ul，然后放3～4h再测？是为了节省试剂？我想在某种程度上时间可能更重要些，但为什么不增加MTT的量，减少孵育时间呢？
从我的实验来看，增加MTT、降低孵育时间是可行的。但是现在也存在一个问题，就是即使用到5000/well，现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上。是否有MTT增加的原因？这个还在进行验证。
希望有我这种实验经历和想法的同行一起讨论。
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