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【讨论贴】蛋白质大生产，欢迎群友参与～～～
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看了许多帖子，大家大多是谈的实验操作问题，很少涉及大生产的问题，不像其他板块。其实目前蛋白质大生产前景看好，许多蛋白质表现出很好的生理药理活性，如何使这些蛋白质转化为生产力，为社会，为大家，为自己，带来经济效益，也有社会效益，一举几的？
蛋白质药物，要走出实验室应该说是我们的责任和义务。建议大家不要拘泥于瓶瓶罐罐。即便是瓶瓶罐罐，也要想着能不能工业化。说的大一点为了振兴民族工业，说的小一点为了自己的钱途。
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ukonptp (2014-4-19 16:54:08)
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论坛上很多人都很擅长于蛋白质的纯化，但是大家很少涉及与对于一个实验室的纯化方法是否可以放大成可行的纯化工艺，应用于生产，或者要求更高的话适合于GMP的种种验证。
正如GE公司所言：精心筹备的技术转化基础上建立起平稳、顺利的放大程序，将保证产品质量，节约整体成本，及时获得市场认可。
在这里我们可以举个例子说明工艺设计的重要性：例如：我们在纯化前处理时常常选择反复冻融（-20度）来破碎细胞（一般为几十毫升以下的样品），但是如果是在生产中处理几百升样品，等待样品溶化的时间成本以及在溶化过程中蛋白损失就是不可预计的，所以这种工艺是不适合放大的
例如：现在很多人使用protein A作为亲和层析配基，而在GMP中必须验证protein A的脱落是否对你的产品质量造成影响，如果你的产品是药，是否会引起病人的其它方面的副作用
现阶段正在研究纯化的工艺放大，想与在座的同志一起探讨一下：纯化工艺的放大[/url]
ukonptp (2014-4-19 16:55:17)
首先介绍一下
工艺卫生的重要性：
Cleaning in place（CIP）：Test 100’s of cycles at small scale
目的：为了降低可能产生有害物质的产品的污染；延长凝胶的使用寿命，减少重装柱的次数
• 预防步骤
• 在位清洗（CIP）
• 在位消毒（SIP）
• 在位消毒 [SIP] 的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1M NaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。在位清洗 [CIP] 的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP 时，往往已经包含了SIP，不必再重复。
• 生物活性物质的灭活
在位清洗（CIP）
• 可以避免污染物进入下一个步骤
• 延长层析柱的使用寿命
• 减少重新装柱的次数
• 每3-10循环后至少做一次CIP
• 最好使用倒流的方式
ukonptp (2014-4-19 16:55:39)
首先：工艺设计考虑的因素包括：
• 原料的性质:蛋白，血浆，疫苗等
• 蛋白稳定性
• 产品特性
• 纯化的策略
• 过程优化（重要和不重要的参数）
• 可放大性和工艺稳定性
• 环境
• 专利
• 经济成本
• 文件和可行性计划
• 质量保证：分析方法和过程控制
在这里：哪些会影响产品稳定性？包括：蛋白浓度、游离蛋白、温度、促溶剂、pH、蛋白酶、辅助因子、Buffer组成
层析树脂的选择
•使用预装柱进行筛选：技术支持，可放大性，稳定供货，在NaOH中的稳定性
•选择有相应的检测方法的层析介质：载量，装柱，寿命，可重复性（验证三批连续批号的胶）这里考虑介质产家最好是能够提高符合GMP验证文件要求的产家，可以稳定供货
ukonptp (2014-4-19 16:56:02)
一般从小试到生产固定的参数是：相同线性流速、相同缓冲液、相同填料、相同柱高、相同的样品浓度和pH，相同的样品体积和柱床体积比例，相同梯度体积和柱床体积比例
放大的条件是：柱直径、体积流速，上样流速、上样体积、梯度体积
owanaka (2014-4-19 16:56:24)
我说说我的了解吧。
我现在的公司就是中试规模的纯化生产，我自己也在制造部工作，从自己从事生产的体会感觉到以下几点可能是纯化工艺从实验室进入生产最为关键的：
1.工艺的稳定性。工艺稳定是必须的，因为如果从事的是药物生产，你工艺的稳定性是新药申报时很重要的一个看点。工艺不稳定，那么申报时不可能成功，而且在以后的生产过程的批记录里，每步的产量或产率都存在上下限，工艺不稳定的话，呵呵，经常要写偏差报告。
2.纯化工艺的成本。老板们都是资本家，原则上成本越低越好。所以纯化时的填料啊、试剂啊什么的越便宜越好。比如层析，能用DEAE 就不用Ni-NTA，试剂如果能用国产的就不用进口的。
3.纯化工艺的策略。就像大家都知道的一样，即使你的工艺很稳定，每步都有95%以上的收率，那么连续5步后是多少呢？77%左右，所以如何尽量减少纯化的步骤也是很重要的。
以上愚见，抛砖引玉喽，呵呵
ukonptp (2014-4-19 16:56:47)
其实还有一点也很重要：就是在确定生产参数，必须是生产中可以接受的操作范围，例如缓冲液的pH，是不是非要7.4，7.3和7.2是不是也可以阿，因为在生产中大规模的缓冲液配制往往做不到特别的精确，因此在研发过程中必须要验证一个操作范围，在这个范围内纯化工艺都是可以做到。
例如以下参数范围是我们可以做的
62642587.jpg
remenb (2014-4-19 16:57:21)
是啊，一般来说生产过程中的溶液pH不会像实验规模那样容易控制。我觉得你做验证的范围可以是7.2~7.4，但是生产时的记录最好是这样控制：7.3+-0.05。这样在实际操作中用pH计完全可以做得到，而且你实际应用窄范围，验证宽范围也更符合GMP的要求。
ukonptp (2014-4-19 16:57:44)
我总感觉我们现在的方法不太科学
ukonptp (2014-4-19 16:58:09)
在纯化放大时，常常涉及到一些基本的计算：
• Packed bed volume (L) = Column bed height (cm) * crosssectional area (cm2) * x10-3
• Settled chromatography medium volume (L) = Packed bed volume (L) * compression factor
• Slurry volume (L) = Settled chromatography medium volume (L) / (slurry concentration (%) * x*10-2)
因为我们现在用的是GE的介质，所以给大家推荐一个网站，计算就特别方便了
http://www5.gelifesciences.com/a ... r~media_requirement
27227480.jpg
remenb (2014-4-19 16:58:30)
您所说的层析用填料的载量吗？
自己来确定填料载量的确很麻烦，我们用的多得是买来的QIAGEN的Ni-NTA，它应该有载量验证文件，但我的确没有想过这个问题，也没有看过相关文件。因为我们使用时就是根据它所标称的理论载量来计算所需填料体积的。根本没有想过做这方面的验证，在药监局的检查中也没有过异议。按理说Ni-NTA再生后是应该确定载量的，这里应该有个验证，但是的确没有做过。
顺便提一句，就我使用的经验来说，进口填料的标称理论载量都略小于填料实际的载量，也就是说实际上比说明书上写的要大一些。看来老外们做事很有分寸也很严谨啊。
ukonptp (2014-4-19 16:58:50)
是指填料的载量
确定载量，也是为了更好的节约成本，因为我们现在的产品附加值并不是特别高，而纯化往往也是成本最重要的部分
老外的确很严谨，曾经听别人说过，老外真的做CIP，用AKTAexplorer，做一百次，然后验证，感觉好奢侈哦，呵呵
babybabe (2014-4-19 16:59:08)
请问大生产纯化过程中Tris-Hcl缓冲体系，是不是不能用于制药报药方面。
remenb (2014-4-19 16:59:25)
Tris-HCl可以用于制药方面，但是最好要根据产品的性质确定是否可以用，因为Tris是多氨基化合物，你至少要保证你的产品不与之反应，并且所用试剂也最好不能与Tris有反应，否则就要有相关物质的检验方法才行。因为Tris是极为常用的缓冲体系，有时这一点就容易被忽略了。而且Tris体系成本要高于磷酸盐缓冲体系，成本也要考虑。
举个不恰当的例子，以前我上学时做酶的固定化，用酶的游离氨基与固定化载体的环氧基反应，但是就是忽略了Tris的反应能力，所以采用了Tris作为缓冲液。结果Tris 与载体反应了很多，酶都没有连接上。换了磷酸盐就好了：）
lixi559 (2014-4-19 16:59:42)
Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方法.
lixi559 (2014-4-19 16:59:58)
用离子交换是由于参数容易控制PH,离子强度.疏水的参数就比较难控制,样品一变化就难挂上去.
ukonptp (2014-4-19 17:00:27)
QUOTE:
疏水层析pH：在pH5-8.5范围内疏水作用没有很大变化，pH<5.0疏水作用增加，pH>8.5疏水作用减弱
如果用上样高盐的buffer去处理样品，我做的大部分为破胞产物，所以在菌体复溶时就用上样buffer，大部分还是挺容易重复的，没遇见你所说的情况。能举例说一下吗？谢谢
ukonptp (2014-4-19 17:00:55)
同意，一般Capture都不会选择亲和，因为第一步的Capture毕竟杂蛋白还是比较多的
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Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方法.
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ukonptp (2014-4-19 17:01:18)
在研发设计过程中，其实经过预装柱对填料的初选后，就要进行一些初步的计算，因为前面我们也说了：对于层析参数的线性放大的一般原则是：
一般从小试到生产固定的参数是：相同线性流速、相同缓冲液、相同填料、相同柱高、相同的样品浓度和pH，相同的样品体积和柱床体积比例，相同梯度体积和柱床体积比例
放大的条件是：柱直径、体积流速，上样流速、上样体积、梯度体积
所以在小规模必须估计你装多高的填料，放大以后使用什么样的柱子能满足你的生产要求
zsxan1990 (2014-4-19 17:01:39)
最近也在做蛋白纯化，感觉步骤挺繁琐，而且丢失也比较多，特别是用层析柱的方法，最后得率往往都很低，仅做实验用的蛋白有时候就要做好几次，很费时费力，再大量制备运用到实际（如临床）估计更难。所以，我也同大家一样，觉得纯化工艺要放大！还希望大家多多指教：）
babybabe (2014-4-19 17:02:01)
楼上建议你用大柱,不要小家子气一次做一点.
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