【求助】怎么确定表达的目的蛋白为包涵体？

最新回复

• remenb (2014-4-21 17:04:38)

  
  最常用的就是破碎跑胶。
  例如你养500ml的菌，诱导之后三小时收菌、离心，用25mlbuffer悬浮，然后超声破碎，这是你取500ul，当作全蛋白，然后18000离心15分钟，取上清500ul，也可以将下面的沉淀（如果很多发白）用25ml尿素(8M),溶解，然后也取500ul，然后分别加入SDS loadingbuffer，煮沸，然后跑sds-page胶，根据上清和尿素溶解的蛋白中在全蛋白中的比例就可以判断，你的目的蛋白主要是以包涵体还是上清的形式存在了。

• c86v (2014-4-21 17:05:00)

  我还想请问一下，如果没有超声波破碎，能否用溶菌酶或其他方法替代超声波法提取蛋白吗？因为我们实验室没有超声波设备。刚接触做蛋白，都不懂，请多帮忙！谢谢！

• remenb (2014-4-21 17:05:21)

  也可以还有两种方法，比较简单
  一种就是你说的溶菌酶反复冻融
  第二种，更加简单，需要用到glass beads就是玻璃珠破碎法。
  简单的说，将诱导之后的菌液，取两个EP管，一个加1ml，另一个加5ml（离心、倒掉，5次），然后用100ul水悬浮，第一个当做全蛋白，第二个加入几十微生的玻璃珠，放在振荡器上震荡5分钟，然后离心5分钟，取上清100ul，这个当作胞质蛋白，然后同样加sdsbuffer跑胶比较就可以了。

• 98776langtao (2014-4-21 17:10:49)

  呵呵，我再补充一点，在破菌以后，一定要注意破菌buffer的选择，有的蛋白虽然是可溶性表达，但是在破菌buffer里的溶解度很低，离心时可能同样会沉积在底部，这时可能就会把这部分可溶性表达的蛋白也当作包涵体形式表达的了，所以在破菌溶解的时候，可以把破菌液体积放大或者改变离子强度、pH值之类的方法，尽可能使可溶性蛋白全部溶解，然后再拿上清和沉淀分别跑电泳，这时的结果才更准确些。

• bring (2014-4-21 17:11:14)

  也可以还有两种方法，比较简单
  一种就是你说的溶菌酶反复冻融
  第二种，更加简单，需要用到glass beads就是玻璃珠破碎法。
  简单的说，将诱导之后的菌液，取两个EP管，一个加1ml，另一个加5ml（离心、倒掉，5次），然后用100ul水悬浮，第一个当做全蛋白，第二个加入几十微生的玻璃珠，放在振荡器上震荡5分钟，然后离心5分钟，取上清100ul，这个当作胞质蛋白，然后同样加sdsbuffer跑胶比较就可以了。
  ......
  
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  请教：这个玻璃珠是什么东东？有正式名称吗？

• remenb (2014-4-21 17:11:41)

  
  glass beads，应该 很多生物公司卖吧

• c86v (2014-4-21 17:12:03)

  我还想问一下，如果我采取的是溶菌酶反复冻融法，那么具体溶菌酶要处理多久，反复冻融几次？每次多长时间呢？我原来只是加入溶菌酶混匀，然后就离心提蛋白了，是不是做的不对啊？
  刚刚接触蛋白，不了解，可能提的问题太幼稚，请大家多帮忙！谢谢！

• c86v (2014-4-21 17:12:23)

  
  还想问问，各位高手，有没有具体提蛋白的方法和操作步骤之类的。谢谢！

• summerxx (2014-4-21 17:13:01)

  似乎和载体有关，不知道你用的是什么载体。一般溶菌酶放室温半小时就可以了，这时候用枪头吸就比较粘稠了，至于反复冻融几次，倒是没有做过，我们就是用超声，比较省时间。另外，具体的纯化方法，你应该查阅载体手册。
  反复冻融法，找到以下几个链接，请参阅：
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/8009592')
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1514600_1.html')
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5045954&sty=3&keywords=%B7%B4%B8%B4%B6%B3%C8%DA')
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=2046735&sty=3&keywords=%B7%B4%B8%B4%B6%B3%C8%DA')