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维生素K的测定（四）
关键词：食品安全检测 农药标准物质 无机标准样品 进口标准物质维生素K的测定（四）
5．HPLC色谱分析
色谱条件(推荐条件)：
预柱ultrapack ODS，10µm，4．0 mm×4．5 cm。
分析柱：ultrasphere ODS，C18，5µm，4．6 mm×250 mm。
流动相：甲醇+正己烷(98+2)。混匀，临用前脱气。
进样量：20µL。
流速：1．5 mL／min。
紫外检测器：波长248 nm。量程0．01～O．05。
HPLC稳定性的测定：取标准应用液连续进行6次HPLC测定，计算峰面积或峰高的平均值、标准差和RSD％，如果RSD<1％，说明仪器稳定性良好。仪器稳定后方可进行样品测定。
6．样品分析
取样晶净化液20µL，按色谱条件进行定性、定量测定。
①定性：用标准色谱峰的保留时间定性。
②定量：用样品峰面积或峰高在标准工作曲线上查出其相应的维生素K1含量，或用回归方程求出其含量。
7．计算
X=(m1*2*V2*100)/(m*V1)
式中：X——样品中维生素Kl的含量，µg·(100 g) -1；
m2——由标准工作曲线上查出或回归方程求出的维生素K1含量，µg；
2——样品提取后的定容体积，m L；
V1——样品净化处理时的取液量，mL；
V2——样品净化后的定容体积，mL；
m——样品质量，g。
8．注意事项
①允许差及最小检出量：同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10％，本法最小检出限为0．5 mg。
②维生素K1具有很强的亲脂性，溶于丙酮、石油醚、正己烷、异辛烷等溶剂中，而不易溶于甲醇、乙醇等溶剂中。当样品中含有较多的水分时，如直接用石油醚或正己烷提取会使样品变黏，因此，样品需先用丙酮提取，或先用无水Na2S04研磨再用丙酮提取，可起到吸收水分的作用，进一步地破坏样品的细胞组织，使提取效果更佳。
③如果氧化铝色谱柱柱效良好，首先被石油醚洗脱出来的应是胡萝卜素，且柱上没有胡萝卜素黄色带扩散的现象；叶绿素及其他色素停留在色谱柱的上方，没有或仅有少量位移，但不影响分离效果。
④洗脱液中乙醚含量的多少影响着洗脱液的极性，如果乙醚含量少，可使维生素K1的保留时间延长；反之，会使干扰物质被提前洗脱，影响净化效果。所以应严格控制洗脱液中乙醚的比例。
⑤根据标准维生素K1紫外扫描图谱，可见维生素K1于240、248、260、269 nm波长处有4个特征峰，其中260 nm的峰最低。将标准品用HPLC测定，以260 nm波长下的峰面积为1，则240、248 nm和269 nm波长下的峰面积分别为1．15、1．23、1．09。
⑥一般反相色谱，多用有极性的甲醇作为流动相。在甲醇中加人适量的非极性有机熔剂(如正己烷、异辛烷等)，可以增加维生素K1的溶解能力，有利于缩短保留时间，减少出峰拖尾现象。本方法选择甲醇+正己烷(98+2)作为流动相，维生素K1的保留时间为(15．6±0．1)min。
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