【求助】细胞免疫荧光

最新回复

• summerxx (2015-2-24 00:05:00)

  
  透膜可以试一下这个0.25%Triton X-100,10min；一抗孵育改为4°C 6小时；另外抗体滴度是需要多摸索一下的
  

• misswu61 (2015-2-24 00:05:22)

  QUOTE:

  原帖由 summerxx 于 2015-2-24 00:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  透膜可以试一下这个0.25%Triton X-100,10min；一抗孵育改为4°C 6小时；另外抗体滴度是需要多摸索一下的
  

  谢谢你的建议，我的目标蛋白是细胞膜上的，所以没有选择Triton X-100。一抗用的是1:100的

• misswu61 (2015-2-24 00:05:42)

  QUOTE:

  原帖由 summerxx 于 2015-2-24 00:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  透膜可以试一下这个0.25%Triton X-100,10min；一抗孵育改为4°C 6小时；另外抗体滴度是需要多摸索一下的
  

  最烦人的是我的空白和实验显示同样的荧光，这让我怀疑我的全是非特异性染色。我把曝光时间调到了800ms才有现在看到的结果。

• 月牙牙 (2015-2-24 00:06:02)

  你好，我也要做免疫荧光，之前没有做过，请问你做的时候是先爬片的吗？照相时需不需暗室或遮光啊？
  

• bangqi_k (2015-2-24 00:06:41)

  QUOTE:

  原帖由 月牙牙 于 2015-2-24 00:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你好，我也要做免疫荧光，之前没有做过，请问你做的时候是先爬片的吗？照相时需不需暗室或遮光啊？
  

  爬片，需要避光

• bangqi_k (2015-2-24 00:07:14)

  
  很明显，这不是膜定位，可以考虑抗体质量不行，或者串光了，你这个实验可以考虑不打孔，
  

• 911 (2015-2-24 00:07:31)

  空白如此，要找找原因

• misswu61 (2015-2-24 00:08:00)

  QUOTE:

  原帖由 月牙牙 于 2015-2-24 00:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你好，我也要做免疫荧光，之前没有做过，请问你做的时候是先爬片的吗？照相时需不需暗室或遮光啊？
  

  我没有爬片 直接在24孔板里面做的。拍照要避光，最好就是黑暗环境

• misswu61 (2015-2-24 00:08:22)

  QUOTE:

  原帖由 kent 于 2015-2-24 00:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我们做的时候是 0.2%Triton X-100  这个透化的时间不同细胞不一样，不透化效果也还可以。一抗我们做的是4度过夜，如果抗体结合效果不好可以先37度孵育1h后4度过夜。  其他没什么了   看你这个DAPI还可以  可能是抗体的 ...

  谢谢你的建议 我4℃过夜做了一下 同样的操作有时候能拍到荧光 有时候不能，很是奇怪。而且荧光上比面图片好看多了，但不是很强

• misswu61 (2015-2-24 00:08:40)

  很明显，这不是膜定位，可以考虑抗体质量不行，或者串光了，你这个实验可以考虑不打孔，
  
  ------------------------------------------------------------------
  
  你好，可不可以说一下不是膜定位的原因？

• misswu61 (2015-2-24 00:08:58)

  空白如此，要找找原因
  
  ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
  
  我一直在摸索，现在我都怀疑是一抗了。不过也有可以我自己技术不行，忽略了一些细节

• bangqi_k (2015-2-24 00:09:19)

  
  膜定位应该是细胞周围一圈的，你也可以用一些膜蛋白抗体做个共定位

• gemei0115 (2015-2-24 00:09:38)

  
  你自己都分析出来了，我不认为是实验操作问题，你的实验组和 对照组的荧光效果来看是一样的，在膜上都标记上了，只能说明你的蛋白非特异，之前的实验组做的有问题， 再就是 你的抗体有问题，国产的？ 特异性低！
  

• misswu61 (2015-2-24 00:10:09)

  你自己都分析出来了，我不认为是实验操作问题，你的实验组和 对照组的荧光效果来看是一样的，在膜上都标记上 ...
  
  -------------------------------------------------------
  
  你好，我买的抗体是santa cruz的

• dreaming (2015-2-24 00:10:31)

  你的绿色亮点应该是非特异性的  是不是二抗不好？
  

• misswu61 (2015-2-24 00:11:00)

  QUOTE:

  原帖由 dreaming 于 2015-2-24 00:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你的绿色亮点应该是非特异性的  是不是二抗不好？
  

  换了二抗 结果还一样的