【求助】引物间形成二聚体怎么办？

最新回复

• woshi (2015-6-03 15:39:08)

  
  不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。除此之外，形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。

• whitesheep (2015-6-03 15:40:48)

  我认为应该在PCR程序中，把循环中的退火温度提高才对，避免二聚体的形成。必要的时候，做两步PCR——退火和延伸都在70或72度进行。

• dog002 (2015-6-03 15:41:05)

  有一种特殊的引物方案可以最大限度地减少引物二聚体。
  此方法是在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个循环时引物二聚体产物会自身退火形成发卡结构而阻碍继续扩增。具体的文献不在手边，有空再替您找找^_^

• woshi (2015-6-03 15:41:20)

  多谢各位，可惜我这段序列是插在GST载体上，不能随便改酶切位点的。所以只能用目前的引物。

• kulee (2015-6-03 15:42:08)

  兄弟，酶切位点不会改变的，只不过是在原有引物序列的5‘端加上一段额外序列，P完后用酶切一下不就ok了么？
  文献为:
  Jannine Brownie, The elimination of primer-dimer accumulation in PCR, Nucleic Acids Research, 1997,25:3235-3241

• bring (2015-6-03 15:42:26)

  考虑一下用热启动Taq酶吧，我记得好像QIAGEN 和Invitrogen都有一种HotStarTaq DNA polymerase, 该酶在室温时是没有活性的，必须95度15 min进行热激活，这样在热激活的时候使室温配PCR反应体系时引物形成的二聚体解链，接下来直接进入PCR，形成引物二聚体的机会就少多了。值得一试，只是该酶比较贵。

• 969 (2015-6-03 15:42:49)

  
  QIAGEN的hotstar比较好使,的确挺贵，但是有时候也不是适合所有的反应。

• JK.jon (2015-6-03 15:43:05)

  我的经验是：使用booster PCR.尽量降低引物浓度，使引物和模版的浓度比降下来，提高模版对引物的竞争力。

• JK.jon (2015-6-03 15:48:28)

  我一直在用hotstar，感觉不错。

• JK.jon (2015-6-03 15:49:09)

  整个操作应在冰上进行

• xue258 (2015-6-03 15:49:26)

  适当提高退火温度并调整体系中的Mg2+浓度，结合热启动，通常可以有效减少引物二聚体的量。当然，你同时也可以减少引物的量，也会有一定的帮助。

• milkdog (2015-6-03 15:50:39)

  有一种特殊的引物方案可以最大限度地减少引物二聚体。
  此方法是在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个循环时引物二聚体产物会自身退火形成发卡结构而阻碍继续扩增。具体的文献不在手边，有空再替您找找^_^
  
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  这不是跟抑制性PCR一个道理吗？

• zhy平平 (2015-6-03 15:50:55)

  
  我在做的时侯也遇到同样的问题,最后我提高退火温度,同时减少引物的用量就可以将条带扩增出来了,但是要注意扩增结果,我阔出的结果不是很亮,最后优化Mg2+,酶,多家一些模板就可以了

• am10 (2015-6-03 15:51:18)

  我一直在用hotstar，感觉不错。
  
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  你能具体讲解一下什么是热启动，如何操作吗？

• remonte (2015-6-03 15:51:35)

  热启动吗？好像有些酶要在９４度６－10min才能达到最佳酶活，所以在扩增前，先将体系在９４度处理一下

• qianqin1977 (2015-6-03 15:51:50)

  QIAGEN 的hotstar 热启动是95度15分。就是在你的PCR程序上在循环前加上热启动步骤。

• youyou99 (2015-6-03 15:52:25)

  
  提高退火温度

• S6044 (2015-6-03 15:53:00)

  我以前做热启动是这样做的，1.将样品加好后，放于冰上；2.启动PCR仪，待温度上升至70-85度时，迅速将样品放于PCR仪中进行反应。我们也有人是这样做的：先将样品加好（除酶外），然后把样品放于PCR仪中反应，待温度为94度时，再加入酶于样品中，然后按程序进行反应即可。

• yizhi (2015-6-03 15:57:32)

  
  考虑一下体系，包括你的引物浓度，dNTP浓度，DNA浓度，Mg++浓度，还有你的Taq酶，因为你问题的确很麻烦，必须好好优化体系，慢慢的一步一步来，不要怕麻烦，OK!

• youyou99 (2015-6-03 15:57:50)

  
  我有一个问题：
  在进行hotstart的时候，酶是最后才加的,加完了以后还需要混匀吗？