【求助】磷酸化蛋白WB结果不是非特异条带就是白板

最新回复

• fei1226com (2013-12-18 15:15:44)

  
  我不是有经验的同学，但我觉得你要调抗体浓度，试着把二抗浓度加大点，不要一抗二抗同时稀释，那样你就发现不了是谁浓度的问题了。或者用脱脂奶封闭，二抗用1：5000试试。我一般封闭一个小时就可以的，我用的是脱脂奶，但后来有一个蛋白出的不太好，我也在寻找帮助呢

• shenkunjie (2013-12-18 15:16:50)

  
  谢谢！
  之前很多人都说用BSA封闭更好，所以我后几次用的都是BSA，不知道你用脱脂奶1h也是磷酸化蛋白吗？二抗1：5000不变，一抗不同梯度都几乎是白板。

• shenkunjie (2013-12-18 15:19:54)

  请问谁还有好的建议吗？我实在不知道怎么下一步怎么改变条件了
  之前帖子上有人说“封闭液封闭时间不宜过长，否则会置换掉膜上的蛋白”，请问这种说法对吗？

• yjf1026 (2013-12-18 15:20:13)

  
  你用牛奶封闭的时候，有出条带，那你应该尝试一下使用牛奶的情况下，分别降低一点一抗和二抗浓度会不会有条带。比如你可以做两次这样的：
  1，5%牛奶，一抗1:3000，二抗1:4000
  2，5%牛奶，一抗1:2000，二抗1:5000
  对于特定的蛋白，用牛奶和用BSA常常会出现不同的结果。

• shenkunjie (2013-12-18 15:22:02)

  之前试过你说的第二种方法，不过当时压了30min白板就没继续延长时间。
  今天3%BSA，2h，一抗1：2000,二抗1：5000，结果marker也曝出来了，非特异性条带比目的条带深很多，考虑是不是应该封闭过夜，并且提高一抗浓度才行？

• ladyhuahua (2013-12-18 15:22:31)

  
  我做的是磷酸化蛋白，脱脂奶封闭1小时。
  我觉得你可以继续稀释下二抗的浓度，一抗就用1：2000。如果目的条带不是很浅可以不换一抗浓度。还有就是你做的是组织还是细胞，有时候蛋白提取不好时做的条带也不好，蛋白提取也很重要。如果都没问题，建议你换用一下二抗试试，找其他同学的好的二抗试用一下。

• shenkunjie (2013-12-18 15:23:29)

  
  结果还是不理想，郁闷ing~
  3%BSA 4度过夜，一抗1：2000 4度过夜，TBST10*4，二抗1:5000,RT 30min，TBST10*5，结果还是有maker显色，奇怪的是一张膜上一些目的条带和非特异性条带同时出现，另一些基本什么都没有，不知道什么原因？
  难道真的如楼上 战友说的蛋白提取有问题？

• 小糖块 (2013-12-18 15:36:30)

  
  以前我也做过磷酸化蛋白WB,封闭1小时,没问题的也没杂带.个人觉得上面说的蛋白制样和抗体的问题值得考虑.国内抗体就没国外的好

• H2O (2013-12-18 15:38:54)

  
  据说磷酸化的蛋白很容易脱磷酸化，所以样品一定要新鲜的，一般是一周以内的。不知是否准确？

• shenkunjie (2013-12-18 15:43:29)

  
  抗体是CST的，质量应该没问题；样品的确不新鲜了，因为做的是师姐留下的组织蛋白，有好几个月了，不过是加了裂解液（含NaF,Na3VO4)放在-70保存的。

• kuohao17 (2013-12-18 15:49:07)

  
  我的建议是既然你可以做出来目的条带，而且比较深，那么基本就是封闭的问题了，上面看到你的封闭液，那么你可以试试同时加bsa和脱脂奶粉的配方，就是说可以用含3%bsa和2%脱脂奶粉的封闭液试试，或者其他的组合。有些蛋白就需要这样的封闭液才能出好的结果。一抗1：2000， 二抗1:5000应该没有问题，做出来结果及时反馈，我们再商量。

• yonger (2013-12-18 15:49:41)

  
  我感觉就是你的蛋白问题了，存放那么久了。忘了问，你的内参出的好吗？如果内参都不好就肯定是蛋白的问题了。如果再不理想，你可以试着取点新鲜标本试试

• yonger (2013-12-18 15:49:57)

  
  marker显色说明你的转膜和抗体没问题，但目的蛋白没出来我感觉就是目的蛋白的问题了

• 3N4G (2013-12-18 15:50:59)

  
  应该是蛋白的问题，呵呵，建议重提，提的时候要多加小心：）祝实验顺利

• jujuba (2013-12-18 15:52:57)

  
  我做过酪氨酸磷酸化蛋白STAT1的WB, 个人感觉一抗一般不会有什么问题,关键是蛋白的制备,要用酪氨酸蛋白酶抑制剂,普通的方法是做不出来的

• tangxin_80 (2013-12-18 15:53:18)

  
  我觉得你的二抗只抚育30分,好象短吧,我的都抚育2小时的,而且磷酸化结果很好.

• greenbee (2013-12-18 15:53:44)

  我也在做磷酸化酪氨酸蛋白的WB，有时候同样出现你所说的问题。我做的是组织的蛋白，不知道你的蛋白是细胞的还是组织的。我们的经验和处理方式如下：
  1 磷酸化酪氨酸蛋白极容易降解，所以，在制备组织样本的时候需要注意加入多种磷酸酶的抑制剂： 我们加入的蛋白酶抑制剂的种类比较多，包括protein inhibitor II和III（Merck产品），矾酸钠、甘油磷酸钠等，此外，裂解液中还加入还原剂DTT。即使是这样，我们的结果还是不太稳定，教授和国外的同行就结果讨论了很多次，最后反复修改蛋白的处理方法，现在结果已经相对好了很多。所以，如何保持组织的磷酸化蛋白不被降解是WB的前提和关键所在。
  2 抗体：我们用的抗体是Upstate的4G10 anti-phosphotyrosine抗体，即使如此，结果也是一般般，有时候好，有时候就是白板。就在昨天，教授已经下令让我寻找了多家公司的抗体，最终没有办法，还是重新订购了Upstate的同一种抗体（原因是教授认为国内的公司在运输抗体的过程中可能会出现问题，从而导致抗体的效度出现误差，即使是同一家公司）。另外晶美公司有代理Souther Biotech的抗磷酸化酪氨酸抗体，但是由于不是4G10（被认为是金标准），虽然价格很便宜910元，我们还是选择了Upstate。
  综合上述，你可以考虑下你的样品制备和抗体。
  如果需要样品裂解液的配方，可以PM我^_^

• 喵咪 (2013-12-18 15:54:08)

  
  在学习中成长，我通过学习各位的见解：1。磷酸化的蛋白样品不稳定，请确保样品可靠性，最好正确使用新近制备的样品。
  2.拿到一抗、二抗请及时分装保存使用，二抗建议你使用另外的公司，我用过博奥森的二抗，耽误我半年时间，我始终认为是自己问题，后来换了博士德的抗体，问题解决了；建议你：如果老板有钱就买原装进口的二抗（千万不要用分装的），如果老板没钱可以买博士德的。
  3.建议你摸条件的时候设计好逐层改变条件，最好同时进行平行实验，从你提供的实验结果来看，我觉得二抗的浓度问题不大

• u234 (2013-12-18 15:54:38)

  大家好！
  我用同样的蛋白样品，5%BSA封闭2h，一抗1：2000 4度过夜，TBST10*4，二抗（换别人的，北京中衫）1:5000，RT 30min，TBST10*5，结果终于好很多，目的条带比较明显，基本没有背景，不过还是有浅的非特条带，看来是博奥森的二抗太差了！考虑这两天再优化一下实验条件。
  感谢各位战友这些日子对我的帮助！

• tie8 (2013-12-18 15:55:04)

  
  恭喜您结果有所改善，能否将您结果前后对比的图贴出来，再分析下是否确实是二抗的原因。