【求助】提出的蛋白太黏稠如何做？

最新回复

• wawa (2014-4-13 22:57:56)

  
  裂解配方是否含有一些必要的成分，比如说去垢剂，盐离子浓度，蛋白酶抑制剂等,MgCl2 CaCl2等
  其他引起粘稠的最主要的原因是核酸和蛋白混在一起，可以试着加点核酸酶，降解掉核酸，释放蛋白。
  不过看楼主的描述，我觉得这个“粘稠的鼻涕”，有点夸张啊，超过俺的想象范围，呵呵

• wawa (2014-4-13 22:58:14)

  另外如果是做WB的话，给个建议，直接将细胞加了SDSpage的loading buffer，超声一下，然后直接加热，让蛋白都变性，离心后就可以上样跑电泳了

• dmg (2014-4-13 22:58:50)

  
  我买的是RIPA裂解液，PMSF的终浓度大于1mM。也不知道是不是由于加少的原因
  楼上所说的是另外一种提取蛋白的方法，但是就我这种情况，应该如何补救呢？

• wawa (2014-4-13 22:59:13)

  
  加样品等体积的2X的loading buffer,然后超声，然后煮沸

• dmg (2014-4-13 22:59:36)

  
  哦？wawa学长的意思是：下次从冰箱中拿出这次提取的黏稠蛋白，加入上样buffer后再超声？请问这么做的原因是什么呢？如果先超声再离心，然后加上样buffer煮沸与您说的差别在哪里呢？
  谢谢赐教：）

• zhenxin (2014-4-13 23:00:09)

  
  正常得蛋白不会有像你所说得那种“鼻涕”，怀疑你提得蛋白是否是“糖”
  造成得原因也不应该是你所说得裂解液+少了造成得
  检查你得试验
  等你的好消息
  good luck!!!!!!

• dmg (2014-4-13 23:00:32)

  
  怎么会是糖呢？昨天也用这种同样的试剂和方法提就提得很好。应该是密度大的原因，不过肯定是要试一下的。就是不知道到蛋白定量的时候如果吸不上来应该怎么办了？

• DNA (2014-4-13 23:00:59)

  
  会不会是由于裂解液加入的量太少，加上超声波破碎不够，导致核酸没有断裂，与蛋白交缠在一起。
  另外如果要做western-blot，建议加完Loading buffer后，上样前高速离心以下，不然的话可能电泳效果很差，反正如果没有溶解在Loading buffer里的蛋白也不能进胶。
  good luck！

• dmg (2014-4-13 23:01:18)

  是啊，我觉得是裂解液加入的量太少了，超声了6次，这个应该还是正常。
  请问我在加入loading buffer前还能够超声10次再离心然后定量麽？

• wawa (2014-4-13 23:01:57)

  QUOTE:

  原帖由 dmg 于 2014-4-13 22:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  哦？wawa学长的意思是：下次从冰箱中拿出这次提取的黏稠蛋白，加入上样buffer后再超声？请问这么做的原因是什么呢？如果先超声再离心，然后加上样buffer煮沸与您说的差别在哪里呢？
  谢谢赐教：） ...

  这样也可以
  我觉得实验更多的时候需要自己测试，上面这些战友说的都有一些道理，具体你这个是什么原因，光听你这么简单的说，估计也确定不了，多做几个对照组，看哪个效果最好

• 松子儿 (2014-4-13 23:02:18)

  
  你可以用高转速18000转以上大离心机离心15分钟，应该会有胶状或絮状沉淀。还有蛋白浓度高的粘稠状态和菌代谢物的粘稠状态不一样。你自己观察一下。

• 松子儿 (2014-4-13 23:02:51)

  蛋白浓度高的粘稠不会让你吸不上来。除非里面还有糖之类的代谢物。

• dmg (2014-4-13 23:03:28)

  
  请问里面怎么会有糖代谢物呢？这方面我是一点都不懂啊，应该怎么样改善这个情况呢？

• 分子式 (2014-4-13 23:03:46)

  
  再加入一倍裂解液。
  或者取出少部分加入一倍裂解液，如果不溶，再加入一倍裂解液，直至溶解，测蛋白浓度。

• dmg (2014-4-13 23:04:54)

  
  哦？请问楼上的试过这种方法么？像我现在有絮状物黏稠，是不是按照你这样的稀释能够变清亮呢？
  谢谢

• tie8 (2014-4-13 23:05:58)

  
  同意再多加一倍裂解液 可以尝试再次超声
  你的超声是否正确操作了？
  按理说超声本身就能使细胞膜破裂，DNA断裂
  鼻涕状态也就不该存在了
  还有个超笨的方法 如果不是定量研究的话 可以加SDS loading buffer后煮沸 7分钟， 离心取上清，作个上样量的梯度，总有一个浓度合适……

• dmg (2014-4-13 23:08:03)

  就是把探头插入液面一下，时间定的5秒，间隔3秒，超5－6次
  主要是有时候又正常，有时候又很黏稠，找不到原因也麻烦

• dmg (2014-4-13 23:08:55)

  
  采用不同配制比例，终于找到原因了
  1号瓶：98ul RIPA裂解液+2ul PMSF(80mM)配制 加80ul
  2号瓶：98ul RIPA裂解液+2ul PMSF(80mM)配制 加100ul
  3号瓶：98ul RIPA裂解液+2ul PMSF(80mM)配制 加120ul
  4号瓶：98ul RIPA裂解液+2ul PMSF(80mM)配制 加150ul
  5号瓶：90ul RIPA裂解液+10ul PMSF(80mM)配制 加100ul
  超声6次，离心4度 14000g 6min
  结果发现，1－4号瓶都是像以前一样，非常黏稠，而第5瓶则没有这种情况。看来以前是由于PMSF的量不够导致的
  只是不解的是：98ul RIPA裂解液+2ul PMSF(80mM)配制 时，PMSF的终浓度也是大于1mM的，为什么就会出现那种情况呢？

• wzqzy (2014-4-13 23:09:17)

  我的样品也是这样的，第一次还好，但第二次制备出的样品就很黏稠，我用自己配的extraction buffer成分有：urea,thiourea,CHAPS,DTT,pharmalyte,不知是为什麽？

• idea2011 (2014-4-13 23:10:44)

  urea,thiourea,CHAPS,DTT,pharmalyte　我今天上午也是用这个提取的蛋白，提了四个样品，结果三个还好　基本不怎么粘稠，第四个粘的跟鼻涕一样啊１不过没有絮状物，我还拿出来玩了一会！大家快点想办法解决一下这个问题啊！我以前基本没遇到过这样的情况啊！