【求助】单抗药物的糖型分析

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• any333 (2016-4-13 11:44:36)

  测糖型分析，很多人也在用Ludger品牌的东西，还不错，用的PNG酶解，然后2AB标记，纯化后进行分析。有详细步骤，我找下发来给大家参考参考：
  
  -----------------------N-多糖分析
  
  第一步：释放多糖
  
  （用阱解释放试剂盒：LL-HYDRAZ-A2 用于从糖蛋白释放N-/O-多聚糖，4-10℃避光保存）
  
  E-PNG01糖基肽酶（N 糖苷肽酶F）多糖释放酶
  
  E-PNG05糖基肽酶（N 糖苷肽酶F）多糖释放酶
  
  ------------------------------
  
  第二步：标记
  
  2-AB 多糖标记试剂盒LT-KAB-A22-AB  染料标记多糖，室温避光储存 规格：1 kit containing2 Reaction Sets
  
  此外还有比较常用的升级版的，无毒2-AB  多糖标记试剂盒,2PB 作为还原剂规格： 1 kit containing2 Reaction Sets
  
  优点：
  
  多糖可在两小时内标记于2AA 或2AB。这标记试剂盒采用一种无毒的还原试
  
  剂----2-甲基吡啶硼烷(2-PB)，比之前有毒性的氰基氢硼化钠更安全。而这项技术
  
  Ludger 已获得独家专利。
  
  Ludger提供的无毒2AA（货号：LT-KAA-VP24）和2AB（货号：LT-KAB-VP24）多糖标记试剂盒具有以下特点：
  
  1、已通过ICH Q2(R1)认证，进行过β 因素测试
  
  2、精确度高，相对峰面积超过5%，其CVs 是少过5%；相对峰面积低于5%，其
  
  CVs 是少过8%；
  
  3、标记效果与现有有毒性的2-AA 标记试剂盒和2-AB 试剂盒相当；
  
  4、试剂盒含有两个预混合瓶，一瓶是醋酸和DMSO 溶液，另一瓶是有2-PB 的
  
  2-AB 或者2-AA 标记物，因此标记过程简单。
  
  5、2h 内完成标记。
  
  ----------------------

• any333 (2016-4-13 11:49:30)

  第三步：纯化
  
  S 多糖纯化柱 LC-S-A6  【我们就是用的这款柱子进行纯化的，这个好像也是USP推荐的】用于从混合物中分离多糖成分，包括Ludger荧光和发色基团标记的多糖,  纯化2-AB 标记的多糖的传统方法规格：6 units/pack
  
  T1 多糖纯化柱（含真空多联支架）LC-T1-A6用于荧光和发色基团标记的多糖纯化，适合纯化2-AA  和2-AB标记的多糖，用于真空歧管系统，同时可以处理多达96 个样本。规格：6 cartridges
  
  -----------------------------
  
  第四步：用HPLC,UHPLC或MALDI MS分析
  
  高分辨酰胺色谱柱 LS-N2-4.6x150  规格：1 column 用于Ludger荧光和发色基团标记多糖的高效液相色谱分析。
  
  40 倍甲酸铵缓冲液,pH 4.4，LS-N-BUFFX40，规格：1 bottle, 50ml 用于酰胺或HILIC（亲水相互作用）的液相色谱分析
  
  C3高效液相色谱柱LS-C3-7.5x75 规格：1 column 用于带电荷多糖分析
  
  4 倍甲酸铵缓冲液, pH 9  LS-C-BUFFX4 规格：1 bottle, 50ml用于带电荷多糖分析
  
  多糖标准品（标记的/未标记的）－在HPLC或MALDI MS分析中用于参照糖蛋白或多糖文库－用于做标准品或对照品。
  
  【标准品比较齐全，G0,G1,G2, G1F,G2F,G0F都有，还有Man系列的，纯度很好】
  
  碳水化合物单糖：
  
  定量单糖标准品（６种单糖混合物：葡萄糖胺, 半乳糖胺, 半乳糖, 甘露糖,葡萄糖和岩
  
  藻糖)）CM-MONOMIX-10定量唾液酸标准品(NouGc和NouAc)：CM-NEU-GC-01N-羟乙酰神经氨酸定量标准品  和CM-NEU-AC-01N-乙酰神经氨酸定量标准品 鉴定Nou5,9Ac2:CM-NEU5,9,AC-01
  
  梯度葡萄糖同聚物－用作系统适用性标准品和校准GU值。
  
  内切糖苷酶－和LS－N2高分辨酰胺色谱柱（用于Ludger荧光和发色基团标记多糖的高效液相色谱分析）一起用来测定具体结构序列。
  
  目前有国外的和国内的网站：cuturl('www.ludger.com')、cuturl('www.ludgesh.com')

• 101010 (2016-4-13 11:49:45)

  一般是用糖肽酶PNGase F过夜切下来后，沉淀蛋白，上清液收获寡糖，使用HPLC（安捷伦应该就有）分析。看过一份资料，标准品是可以从Prozyme (Hayward,CA, USA)购买。

• nn255 (2016-4-13 11:50:13)

  
  不知各位大侠有没有用液质联用方法分析单抗糖型的呀？盼望交流。。。

• jujuba (2016-4-13 11:50:33)

  
  标准品在Sigma有卖的

• 04906 (2016-4-13 11:52:18)

  
  该试验较复杂，收获寡糖后，使用标志物标记（2-AB）,标记后，除去多余的标记物，再进行NP-HPLC,使用荧光检测器进行检测。

• XYZQ (2016-4-13 11:53:05)

  
  如果质谱分析的话用标记么？

• XYZQ (2016-4-13 11:55:06)

  目前成熟的LOT-RELEASE的方式是用CE么？似乎在文献中也没什么报到，这似乎是商业机密吧？而HPLC 或者是NP-HPLC 分离不同糖型的能力没有CE好，荧光标记，然后CE分离似乎是一个比较正常的方法吧？

• ilovegaga (2016-4-13 11:55:20)

  标品可以从prozyme购买，这家的糖生物块的产品还是蛮齐全的，2-ab的标记试剂盒也有的
  做单抗糖型分析 单抗纯化后 用外切糖苷酶PNase切下糖链 用2-ab or 2-aa进行标记，再除去多余的标记，进行HPLC检测

• any333 (2016-4-13 12:04:33)

  如果质谱分析的话用标记么？
  
  =======================================================================================
  
  质谱应该不标记，液相分析标记是因为使用荧光检测器，不标记没法检测，而质谱是靠荷质比，故应该不需要标记。

• any333 (2016-4-13 12:05:19)

  如果质谱分析的话用标记么？
  
  ==================================================
  
  应该不需要标记，质谱是根据荷质比检测的，标记有何用呢？

• 33号 (2016-4-13 12:05:36)

  质谱也要标记的，因为N-糖本身不容易带上电荷。2-AB修饰后，可以增加离子化效率。有的糖含量比较小，即便修饰了，也不一定能带上电荷

• 00无名指00 (2016-4-13 12:05:51)

  质谱检测一般来说不需要标记，但是lc-ms必须用HIPLC或PGC柱子去做，反向C18柱对没有标记的寡糖完全没有保留。所以，反向柱做寡糖分析，必须标记。但是应当知道的是，标记lc-ms不一定会增强信号（灵敏度），还要考虑到标记后纯化糖的损失和不完全衍生（标记）的现象

• xuuuu (2016-4-13 12:06:12)

  16楼
  测糖型分析，很多人也在用Ludger品牌的东西，还不错，用的PNG酶解，然后2AB标记，纯化后进行分析。有详细步骤，我找下发来给大家参考参考：
  
  -----------------------N-多糖分析
  
  第一步：释放多糖
  
  （用阱解释放试剂盒：LL-HYDRAZ-A2 用于从糖蛋白释放N-/O-多聚糖，4-10℃避光保存）
  
  E-PNG01糖基肽酶（N 糖苷肽酶F）多糖释放酶
  
  E-PNG05糖基肽酶（N 糖苷肽酶F）多糖释放酶
  
  ------------------------------
  
  第二步：标记
  
  2-AB 多糖标记试剂盒LT-KAB-A22-AB  染料标记多糖，室温避光储存 规格：1 kit containing2 Reaction Sets
  
  此外还有比较常用的升级版的，无毒2-AB  多糖标记试剂盒,2PB 作为还原剂规格： 1 kit containing2 Reaction Sets
  
  优点：
  
  多糖可在两小时内标记于2AA 或2AB。这标记试剂盒采用一种无毒的还原试
  
  剂----2-甲基吡啶硼烷(2-PB)，比之前有毒性的氰基氢硼化钠更安全。而这项技术
  
  Ludger 已获得独家专利。
  
  Ludger提供的无毒2AA（货号：LT-KAA-VP24）和2AB（货号：LT-KAB-VP24）多糖标记试剂盒具有以下特点：
  
  1、已通过ICH Q2(R1)认证，进行过β 因素测试
  
  2、精确度高，相对峰面积超过5%，其CVs 是少过5%；相对峰面积低于5%，其
  
  CVs 是少过8%；
  
  3、标记效果与现有有毒性的2-AA 标记试剂盒和2-AB 试剂盒相当；
  
  4、试剂盒含有两个预混合瓶，一瓶是醋酸和DMSO 溶液，另一瓶是有2-PB 的
  
  2-AB 或者2-AA 标记物，因此标记过程简单。
  
  5、2h 内完成标记。
  
  ----------------------
  
  第三步：纯化
  
  S 多糖纯化柱 LC-S-A6  【我们就是用的这款柱子进行纯化的，这个好像也是USP推荐的】用于从混合物中分离多糖成分，包括Ludger荧光和发色基团标记的多糖,  纯化2-AB 标记的多糖的传统方法规格：6 units/pack
  
  T1 多糖纯化柱（含真空多联支架）LC-T1-A6用于荧光和发色基团标记的多糖纯化，适合纯化2-AA  和2-AB标记的多糖，用于真空歧管系统，同时可以处理多达96 个样本。规格：6 cartridges
  
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  第四步：用HPLC,UHPLC或MALDI MS分析
  
  高分辨酰胺色谱柱 LS-N2-4.6x150  规格：1 column 用于Ludger荧光和发色基团标记多糖的高效液相色谱分析。
  
  40 倍甲酸铵缓冲液,pH 4.4，LS-N-BUFFX40，规格：1 bottle, 50ml 用于酰胺或HILIC（亲水相互作用）的液相色谱分析
  
  C3高效液相色谱柱LS-C3-7.5x75 规格：1 column 用于带电荷多糖分析
  
  4 倍甲酸铵缓冲液, pH 9  LS-C-BUFFX4 规格：1 bottle, 50ml用于带电荷多糖分析
  
  多糖标准品（标记的/未标记的）－在HPLC或MALDI MS分析中用于参照糖蛋白或多糖文库－用于做标准品或对照品。
  
  【标准品比较齐全，G0,G1,G2, G1F,G2F,G0F都有，还有Man系列的，纯度很好】
  
  碳水化合物单糖：
  
  定量单糖标准品（６种单糖混合物：葡萄糖胺, 半乳糖胺, 半乳糖, 甘露糖,葡萄糖和岩
  
  藻糖)）CM-MONOMIX-10定量唾液酸标准品(NouGc和NouAc)：CM-NEU-GC-01N-羟乙酰神经氨酸定量标准品  和CM-NEU-AC-01N-乙酰神经氨酸定量标准品 鉴定Nou5,9Ac2:CM-NEU5,9,AC-01
  
  梯度葡萄糖同聚物－用作系统适用性标准品和校准GU值。
  
  内切糖苷酶－和LS－N2高分辨酰胺色谱柱（用于Ludger荧光和发色基团标记多糖的高效液相色谱分析）一起用来测定具体结构序列。
  
  目前有国外的和国内的网站：cuturl('www.ludger.com')、cuturl('www.ludgesh.com')

• xuuuu (2016-4-13 12:07:00)

  
  Prozyme的详细流程，值得参考
  
  
  Deglycosylate with GKE-5006, or GKE-5020 (5020 at higher concentration). Use around 100ug per sample for a mAb, which has 2-3% N-glycosylation by weight (more or less will also work). Many people like to use native conditions for mAb deglycosylation as it can come out of solution in denaturing conditions.
  
  cuturl('http://prozyme.com/collections/pngase-f/products/gke-5006a')
  
  cuturl('http://prozyme.com/collections/pngase-f/products/gke-5020b')
  
  
  
  If the customer is potentially going to buy a lot of enzyme, let us know, maybe there is the opportunity to work with them.
  
  
  
  For cleaning after N-Glycanase (PNGase F) reaction I’d suggest ethanol precipitation, or the R cartridge. Glycan cleanup by ethanol precipitation after digestion & prior to 2-AB labeling has been used by many labs for many years.
  cuturl('http://prozyme.com/products/gki-4756')
  
  
  
  For 2-AB labeling - dry down sample in a SpeedVac then use GKK-804. Better kit than the older GKK-404. The two kits are interchangeable (see attached memo).
  
  cuturl('http://prozyme.com/products/gkk-804')
  
  
  
  For cleanup after labeling, S cartridge (most common) or H:
  cuturl('http://prozyme.com/products/gki-4726')
  
  cuturl('http://prozyme.com/products/gki-4025')
  
  
  None of these use a vacuum manifold. The ones we offer that do, are G and S-plus cartridges.
  cuturl('http://prozyme.com/products/gc250')
  
  cuturl('http://prozyme.com/products/gc210')
  
  
  
  For analysis, HPLC or UPLC is fine. HPLC will just take longer! Most people separate glycans using HILIC columns, Waters BEH glycan column is most popular but Agilent also have the advanceBio glycan mapping column. You can run the UPLC columns under higher pressure for faster/better separation. We run Waters H Class and I Class UPLCs at ProZyme.
  
  Poster:
  
  cuturl('https://cdn.shopify.com/s/files/1/0879/2408/files/Orthogonal_Methods_CE_UPLC_Szabo.pdf?12196421607355723402')
  
  UPLC methods used in poster:
  
  cuturl('https://cdn.shopify.com/s/files/1/0879/2408/files/Orthogonal_Methods_Details_101413.pdf?5845757929709178140')