Cell Counting Kit -8

CCK-8试剂盒
Cell Counting Kit -8
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货号              规格
CT-K-1         1毫升
CT-K-5          5毫升
CT-K-10        10毫升
CT-K-30        30毫升
CT-K-50        50毫升


检测原理
Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒），是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-8属于MTT的升级产品，能在电子载体1-甲氧基PMS的作用下被还原成水溶性甲臜产物，生成的甲臜量与活细胞数量成正比，因此颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，可以反映活细胞数量。

CCK-8法与普通的MTT法相比，具有显著特点：
★灵敏度高，数据可靠，重现性好
★操作简便，省时省力
★水溶性，不需要换液，尤其适合于悬浮细胞
★无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低
★为1瓶溶液，毋需预制，即开即用
★适合于高通量药物筛选
CCK-8用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

CCK-8方法的优势
CCK-8法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
检测方法            MTT法        XTT法        WST-1法        CCK-8法
甲臜产物的水溶性        差（需加有机溶剂溶解后再检测）        好        好        好
产品性状        粉末        2瓶溶液        溶液        1瓶溶液
使用方法        配成溶液后使用        现配现用        即开即用        即开即用
检测灵敏度        高        很高        很高        高
检测时间        较长        较短        较短        最短
检测波长        560-600nm        420-480nm        420-480nm        430-490nm
细胞毒性        高，细胞形态完全消失        很低，细胞形态不变        很低，细胞形态不变        很低，细胞形态不变
试剂稳定性        一般        较差        一般        很好
批量样品检测        可以        非常适合        非常适合        非常适合
便捷程度        一般        便捷        便捷        非常便捷


保存条件：
4ºC避光保存一年有效， -20ºC避光保存两年有效。 避免反复冻融。

CCK-8试剂盒操作说明
CCK-8溶液可直接加入到细胞中，不需要与其它组分预混。由于CCK-8溶液非常稳定并且细胞毒性很小，所以可以进行长时间孵育，例如孵育24-48小时。
在进行以下实验之前，可先设置空白对照孔，仅加入相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液，不加入细胞。
方法一. 制作标准曲线（测定细胞具体数量）
1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。
2、按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。
3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后按培养基体积的10%加入CCK-8试剂，培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）
方法二. 细胞活性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃,5% CO2）。
2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
方法三. 细胞增殖-毒性检测
1、在96孔板中加入90μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。
2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
4、向每孔加入10μL CCK-8溶液。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

活力计算：
细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(不加药)-A(空白)] ×100
A(加药)：具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培养基和CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0 加药)：具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项:
1，由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、 水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
2，本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应， 所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。培养基中酚红和血清的吸光度，在计算时通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
3，有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。加完之后最好能够离心，以免CCK-8液滴悬挂在壁上。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。
4，若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
5，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。白细胞可能需要培养较长时间。若使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
6，若没有450nm的滤光片，可使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
7，金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。
8，本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。


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