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凝胶过滤法分离蛋白质（一）
关键词：食品添加剂检测 环境监测标准物质 煤炭石油成分分析 标准品进口凝胶过滤法分离蛋白质（一）
【实验原理】
凝胶层析法是利用凝胶作为固定相将分子量大小不同的物质进行分离的一种方法。广泛用于分离蛋白质、酶、核酸等高分子物质。其固相载体具有分子筛作用的凝胶可以把分子按分子量或颗粒大小不同而进行分离。凝胶颗粒在适宜的溶液中浸泡，充分吸液膨胀，后装入层析柱中。加入欲分离的混合物后，用同一溶液洗脱，在洗脱过程中，大分子物质由于直径较大，不能进入凝胶颗粒的微孔，而沿凝胶颗粒间的问隙流出，所以流程短，向下移动快。小分子物质可以进入凝胶颗粒微孔内，其流速长，下移速度慢，以致后流出，从而使样本中分子量大小不同的物质得以分离。
在血红蛋白(Mw＝64 500)液中加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw=327．25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖G－25凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。
【试剂与器材】
1．抗凝全血
2．四氯化碳(CCl4)
3．生理盐水
4．交联葡聚糖G-25(细粒)
5．0．1moH。磷酸缓冲液(pH 7．0)
6．0．4％K3Fe(CN)6
7．玻璃层析柱(20cm×2．0cm)
【操作步骤】
1．凝胶准备 称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60mL溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。
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