【求助】疏水层析如何确定平衡和洗脱缓冲液？

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• wood533 (2014-4-21 17:22:21)

  请各位高手帮看看，我不敢确定是不是那么做，我就可以在用2天蛋白纯化仪，下次再用就要7月中旬了，时间宝贵啊！！ 请大家帮帮忙，万分感激！

• ending (2014-4-21 17:22:58)

  
  疏水层析是高盐上样，低盐洗脱，这么看来你的A应该是4mol/L NaCl的pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
  其实你有最好的层析设备AKTA purifier ，你完全可以这么操作（看样子你使用的应该是1ml kit预装柱）：
  A溶液：4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
  B溶液：pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
  然后在AKTA purifier编辑方法，流速流速 1.00 ml/min 上样 2ml ，用然后2CV的A洗脱未结合的蛋白，在20CV（也即是20个柱体积）内线性梯度洗脱，浓度是从0%B变化到100%，然后收集每一管，包括流穿，测定你的目的蛋白在哪一管中，然后从AKTA purifier 的曲线图上，看看你目的蛋白洗脱时的B的浓度（例如50%，也就是2mol/L NaCl ，如果是70%B那就是1.2mol/L NaCl ），就可以确定大概在那个浓度下你的目的蛋白可以被洗脱
  然后编辑方法，用A上样，同样流速同样上样体积，进行梯度洗脱，这个梯度就是你前面摸索到的浓度，如果试验结果你还感觉不满意，那么这个浓度左右进行微调就可以了。

• wood533 (2014-4-21 17:23:25)

  
  太好了，我还一直不太敢确定我的A液呢，做了好多次了，直到前天我才觉得我的A液用的不对，你这么一说我就放心了。
  我是自己装的柱子25ml，昨天白天我跑了一次线性但是很奇怪，竟然没有峰；晚上又跑了个梯度也是没有峰，很是奇怪。
  A溶液：pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
  B溶液：4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
  线性方法编辑：流速流速 1.50 ml/min ，Start-ConcB（%B）我设的是100，那么就是说先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的100%B洗脱未结合的蛋白，在15CV内线性梯度洗脱，浓度是从100%B变化到0%，结果什么也没有。（图在附件里）
  阶段梯度编辑方法：流速流速 1.00 ml/min ，A、B溶液同上，Start-ConcB（%B）仍为100先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的A洗脱未结合的蛋白，设置了5个阶段梯度洗脱（盐浓度是从4到0mol/LNaCl），每个阶段洗脱用4CV，结果仍是什么也没有。

• ending (2014-4-21 17:24:45)

  
  图中的那个峰有你的目的蛋白吗？
  有几种可能性:
  1.目的蛋白没有被洗脱下来，就是你的蛋白和介质的结合力太强了，你可以尝试用水或者pH9.0的缓冲液洗脱一下，看看是否有蛋白被洗脱。如果有目的蛋白被洗脱，你可以降低你上样的盐浓度
  2。确定一下你图中那个尖峰什么？有你的目的蛋白吗？
  
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  太好了，我还一直不太敢确定我的A液呢，做了好多次了，直到前天我才觉得我的A液用的不对，你这么一说我就放心了。
  我是自己装的柱子25ml，昨天白天我跑了一次线性但是很奇怪，竟然没有峰；晚上又跑了个梯度也是没有峰，很是奇怪。
  A溶液：pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
  B溶液：4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
  线性方法编辑：流速流速 1.50 ml/min ，Start-ConcB（%B）我设的是100，那么就是说先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的100%B洗脱未结合的蛋白，在15CV内线性梯度洗脱，浓度是从100%B变化到0%，结果什么也没有。（图在附件里）
  阶段梯度编辑方法：流速流速 1.00 ml/min ，A、B溶液同上，Start-ConcB（%B）仍为100先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的A洗脱未结合的蛋白，设置了5个阶段梯度洗脱（盐浓度是从4到0mol/LNaCl），每个阶段洗脱用4CV，结果仍是什么也没有。
  ......

  
  85966851.jpg

• wood533 (2014-4-21 17:25:19)

  
  那个尖峰（上样时洗脱不结合蛋白的峰），还没有进行正式的洗脱呢。
  你的建议我明白了，1是结合太牢了洗不下来了，2是没有结合上去，是这样理解吧！
  我也跑了一次直接就用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱的，
  先用4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液平衡3CV后，上样，再用4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗3CV到基线水平，最后用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱5CV，结果出峰。图在附件里
  我现在很是疑惑，为什么线性和阶段梯度都不出来，而直接用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱却出了呢？？

• hold住 (2014-4-21 17:25:43)

  
  图中可见换2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱5CV时候电导突然降特别低,所以出峰了,怀疑换缓冲液时没用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱5CV把管道中的水洗干净,所以导致洗出来了.此外需要对各峰进行电泳检测,否则很难知道是什么东西,同时这样也更好摸索条件,否则只看峰是没用的,有的时候活性最高的地方检测器显示不一定是峰,所以活性检测也很重要.没检测手段配合很难做好纯化.

• wood533 (2014-4-21 17:26:24)

  
  我把我的蛋白纯化图都看了一遍，确实每一个出峰的地方都是电导下降的特快，要不我阶段梯度和线性都洗脱不出来峰呢。那这样的问题怎么解决呢，每次清洗完管道后留在管道里的都是纯净水啊？
  是不是可以在没有挂柱子的时候先分别拿缓冲液洗管道，这样的话管道内就会充满溶液了。

• hold住 (2014-4-21 17:28:03)

  
  对,换什么溶液用什么溶液清洗管道和泵,机器本身就可以设定,连着柱子也没关系,清洗泵和管道的时候是不会过柱子的,所以不需要不接柱子,否则挂上的蛋白在你换溶液就被冲下来了.你问问管机器或者用这机器比较熟悉的人,这样会更好点.

• u234 (2014-4-21 17:28:52)

  
  通过你的纯化图谱可以看出：你在梯度洗脱的时候，肯定没有将A、B泵事先平衡好，才出现了电导突然降到很低。一般这种阶梯洗脱的时候，需要先用你所想要的盐浓度，设定好B泵(高盐)的百分比，然后走旁路(即不经过层析柱)，然后让缓冲液的电导平衡到相对应的盐浓度后，才切换管道进柱，这样就不会出现在洗脱过程当中，出现电导变化如此大的情况。你的那个蛋白洗脱峰有可能就是因为电导的急剧下降导致的。
  另外在看一下你加入那么高的盐，上柱前目的蛋白确定还存在吗？有没有可能导致部分沉淀，蛋白量减少，因此你在线性洗脱的时候，蛋白没办法富集，全程都有(蛋白状态不是很均一的时候)，但量都特少，导致洗脱峰不明显或电泳没有目的蛋白。

• wood533 (2014-4-21 17:29:19)

  
  谢谢大家，我一直都没有注意过这个问题真是太感谢了！今天晚上跑的我是先用A、B缓冲液冲的管道，希望明天早晨去了会有个好峰图。我还想请教2个问题？
  1、电导急剧下降的那个峰里（如果我的蛋白正常可以在2M时被洗下来、），是不是应该有我的目的蛋白。
  2、我的目的蛋白是少，一般报道是1L牛乳中只含有8mg目的蛋白，但是现在我跑柱子的时候我的上样量刚是2ml，样品是我第一步蛋白的分离峰（一般会收集有100ml多），而在第二步时则是2ml 的上样，所以现在上样量也是我不知道怎么办的。

• wood533 (2014-4-21 17:29:43)

  
  总结了一下，附件里是我这几次的分离图，疏水层析的原理是高盐上样，低盐洗脱。疏水性强的蛋白先被洗脱下来。
  图3：我原来做的时候把样品的盐浓度增加了，但是平衡液却用的是没有盐的，然后用含盐缓冲液直接洗脱，结果是出峰的，那么在这个峰里的蛋白疏水性是什么样的呢？（如果我的目的蛋白应该在此洗脱液盐浓度（2M）下被洗下来，那么在这个峰里还含有我的蛋白吗？）
  图2：是管道内没有纯净水了，用高盐（4M）平衡后，上样，低盐（2M）洗脱，此时蛋白在280nm下的吸收值很低，是样品中我的目的蛋白含量太低了吗？
  图1：由于管道内水的存在电导急剧下降时出峰，也是高盐平衡后，上样，低盐洗脱，问题还是理论上如果我的蛋白正常的在2M可以都被洗下来，那么这个峰里有吗？（个人理解是：在这个峰里由于是管道内的水做了洗脱液，应该是将所有结合上的蛋白都洗洗下来了吧，从疏水强→弱

• XYZQ (2014-4-21 17:30:31)

  
  只看图是没用的,每个峰都收集跑电泳或者测定活性才知道是不是你的目标蛋白,然后根据结果再调整洗脱的盐浓度,文献不一定全都对或者完全符合你的实验,没检测的纯化差不多算是白做,因此想知道2M可以都被洗下来的是不是你的蛋白跑电泳看位置对不对就知道了.

• wood533 (2014-4-21 17:31:27)

  所谓的活性除了ELISA试剂盒外还有什么更好的检测方法吗？ 电泳我在跑，以前我都是将透析、冻干后的样品跑电泳；对收集的蛋白峰只要蛋白浓度够是不是也可以直接跑电泳而不用浓缩呢？