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【求助】western封闭液

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-6-18 17:02    作者: leifengta    来源: 分析测试百科网

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【求助】western封闭液

请问一下，如果western中使用的5%脱脂奶粉封闭液不是用TBST稀释的，而
是用水稀释的，一抗二抗也是用该封闭液稀释的，会有什么后果？
对结果会有何影响？
谢谢！
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  • duoduo (2014-6-18 17:03:15)

    我认为不会有影响。我做的western中使用的封闭液是1%的BSA,就是用水稀释的，一抗二抗也是用该封闭液稀释的，效果很好！

  • leifengta (2014-6-18 17:03:38)

    我一直都用的水配5%的脱脂奶粉，一抗二抗也是用该封闭液稀释，结果还
    好，但是每次都有很多非特异条带，今天同学看到我配的时候才告诉我应该
    用TBST，晕。。。
    如此操作是否会增加非特异条带，是否会影响抗原抗体反应？
    怎么办呀，现在好着急啊

  • BOSS2011 (2014-6-18 17:03:55)

    那就改为TBST或者PBST（PBS加Tween20），具体会有什么影响还不是很清楚。但是有一点是可以肯定的，溶液的PH值和离子强度是会影响抗体活性的。而且封闭液中加入的Tween20可以增强封闭效果。

  • pengke1983 (2014-6-18 17:04:19)


    Tween20是增加抗体和蛋白结合的特异性的
    在封闭时不加也没什么影响
    我封闭液就是用去离子水配的,过夜封闭
    效果不错
    在杂交的时候稀释一抗和二抗用的是TBST
    二抗杂交时加适量的脱脂乳(大约5%)
    如果不是你抗体本身的问题(特异性不好,浓度过高),一般这样就可以了

  • remonte (2014-6-18 17:04:35)


    如果有非特异条带出现，是不是一抗，二抗作用时间太长了？！抗体作用的时间过长会引起非特异性吸附。我的一抗，二抗作用时间均为室温，摇床1小时

  • applebook=213 (2014-6-18 17:04:51)


    还有啊，可能是二抗放的时间太久了，买新的试试吧。

  • sunnyB (2014-6-18 17:05:12)


    我们的做法是5%脱脂奶粉用1*TBST稀释的，一抗、二抗也用该封闭液稀释，效果不错！你试试看。

  • sunnyB (2014-6-18 17:05:31)


    但是你如果做到磷酸化项目时，就不能用牛奶了，要用BSA，因为牛奶里含有一些磷酸化酶。

  • 98776langtao (2014-6-18 17:05:50)


    我也按你的方法做过,没问题!
    不过这要看运气了,高丰度蛋白影响不大!
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