【求助】 pCR拖尾，没有目的条带

最新回复

• veiwu (2015-4-30 14:17:55)

  
  退火温度太低了吧？

• fei1226com (2015-4-30 14:18:23)

  QUOTE:

  原帖由 veiwu 于 2015-4-30 14:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  退火温度太低了吧？

  用的是two-step protocol，没有退火，直接变性，延伸

• veiwu (2015-4-30 14:18:41)

  QUOTE:

  原帖由 fei1226com 于 2015-4-30 14:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  用的是two-step protocol，没有退火，直接变性，延伸

  哦。那你又重新做了没有？

• ending (2015-4-30 14:19:01)

  
  呵呵，可以不用退火？那不如用标准pcr三步骤试试看吧

• ending (2015-4-30 14:19:35)

  不过就是标准也会出现这种拖尾而且没有目的带，那样原因就多了，是不是dNTPs，酶什么的原因呢。

• fei1226com (2015-4-30 14:19:57)

  QUOTE:

  原帖由 ending 于 2015-4-30 14:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  呵呵，可以不用退火？那不如用标准pcr三步骤试试看吧

  最开始用的是三步法，结果什么都没有P出来，只有引物二聚体

• fei1226com (2015-4-30 14:20:14)

  QUOTE:

  原帖由 ending 于 2015-4-30 14:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  不过就是标准也会出现这种拖尾而且没有目的带，那样原因就多了，是不是dNTPs，酶什么的原因呢。

  下次换换酶，试试能不能P出来，谢谢

• fei1226com (2015-4-30 14:22:00)

  QUOTE:

  原帖由 veiwu 于 2015-4-30 14:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  哦。那你又重新做了没有？

  重新做了，结果照旧，谢谢

• whitesheep (2015-4-30 14:22:19)

  换个酶试试，再确认一下模板有没有问题

• shenkunjie (2015-4-30 14:22:38)

  是不是模板有问题？

• october7 (2015-4-30 14:22:58)

  楼主用的是TOYOBO的kod酶吗？
  

• ritou1985 (2015-4-30 14:34:59)

  引物的问题排除过没呢？

• remonte (2015-4-30 14:35:15)

  
  可能是引物或者PCR循环参数的问题
  

• woshi (2015-4-30 14:38:17)

  如此弥散的条带……首先我想问LZ模板是什么？质粒还是cDNA还是什么？
  一般退火温度低才会这么弥散，不过你用的都是两步法了，退火温度应该不低。你看看你引物的Tm值多少，太低了特异性不高，再看你引物和模板有没有错配。如果能用降落PCR或者巢式PCR可能会显著改善特异性不高的问题。
  

• dior (2015-4-30 14:38:44)

  
  我也碰到过这种问题，我的是酶的问题，换了酶就好了

• vvmmoy (2015-4-30 14:39:21)

  体系有问题？

• youyou99 (2015-4-30 14:39:44)

  用LA试试

• jude (2015-4-30 14:40:48)

  
  也有可能是引物不太好，形成引物多聚体！