【求助】电泳图求助

最新回复

• dmg (2016-2-10 13:37:36)

  
  是不是模板浓度过高！

• 穿越时空 (2016-2-10 13:37:57)

  
  模板我是0.1ug/ul,加的0.5ul.
  应该不会有问题吧^^^

• 555444 (2016-2-10 13:38:14)

  
  可能是跑电泳的电压过高。

• 穿越时空 (2016-2-10 13:38:56)

  
  低电压跑过的,经常也会是这样。

• koook5695 (2016-2-10 13:39:18)

  
  可以降低模板量,加样空里应当是污染的蛋白!

• 穿越时空 (2016-2-10 13:39:38)

  楼上的能否给点再具体的指点,污染的蛋白一般是怎么进入的,模板污染,还是在加样过程中有污染,或者是其它?
  我分析我的模板应该没有污染,买的现成的,质量应该是有保证的.试剂都是用纯水配的.
  欢迎各位园友积极参加讨论,十分感谢!!

• 33号 (2016-2-10 13:40:01)

  
  曾经也疑惑过这个问题,现在说说自己的看法
  从你的电泳图看,你所说道的冲击扇形状条带,MARKER 同样是这样的啊,可以肯定是胶的问题了,你跑了好多次,都是一样的效果应该不是琼脂糖的问题,该怀疑的就只有缓冲液了,不知道你有没有换新的缓冲液试 试,缓冲液跑的时间用的时间太长,更容易变热,且其离子浓度,PH值都会发生变化的.我曾经做过实验,新的缓冲液可以减少"变形"的力度.但是不能变的很平直,我做比较的时候,别的产物可以很平直,唯就某个产物不可以,这说明这个PCR产物的空间结构比较特异吧,具体什么原因就不知道了.
  至于你孔里的亮带,应该是蛋白污染.蛋白污染的表象就是这样啊,跑不出孔,且会吸附在孔周.蛋白可能来自DNA抽提过程中,去蛋白不够完全,RT得到的CDNA同样也是可能有蛋白存在的,这与标本的处理措施及抽提的试剂及人员操作等都有关系,不要太相信花钱的就是好货哦

• eve_49 (2016-2-10 13:40:19)

  根据自己的经验，我认为出现这种情况的常见原因有：
  1、电泳温度过高：建议在低温（60－100°C）下进行凝胶电泳；
  2、电泳液有效成分失效：换新配制的电泳液；
  3、样品上样超载：减少模板DNA的量或在扩增样品和载样缓冲液混合前对样品进行稀释；
  4、凝胶质量差：使用高质量的凝胶可减少脱尾的量；
  5、凝胶配制操作不规范：配制凝胶过程中，拔梳子时用力不均匀，造成梳子空不规整，这样也会影像跑教效果；
  根据你自己的情况，可以考虑逐条核对
  至于加样空亮，我觉得不外乎是你扩增的模板量大或者浓度过高，要么就是如楼上所说是蛋白污染了

• 穿越时空 (2016-2-10 14:02:28)

  谢谢各位的积极参与，从大家的分析中，收获不少。
  我各人还有一种分析，就是我扩增的是大片段的，会不会是扩增过程中有较大的，较杂的片段生成了，所以在胶孔里跑不出来。
  我新贴图大家看看，若是在PCR时添加了甜菜碱的话，点样孔会好很多的，这样是不是可以排除是蛋白污染。

• lagua123 (2016-2-10 14:02:46)

  
  我觉得可能是1.电泳槽阴极和阳性间距离是不是很小,所以电势差较大.
  2.TAP酶及其缓冲液有问题,更换新 的
  3.DNTP的量是不是合适

• dreaming (2016-2-10 14:03:01)

  
  是不是胶有问，你的makers 也是这样。

• cbou876 (2016-2-10 14:03:18)

  
  我以前也遇到过类似的情况。说说我的办法：
  1.更换缓冲液
  2.将点样梳子换成更扁的梳子
  3.降低电压
  4.减少PCR上样量
  改变后，PCR电泳图即变正常。

• zzzz (2016-2-10 14:03:42)

  
  我以前也遇到过类似情况，感觉似是你的模板DNA质量不过关，多糖类或蛋白类含量较高，不知你是做的何种材料？
  mark 也是这样，考虑胶及缓冲液的问题，再就是电压。

• wanglaoshi (2016-2-10 14:04:02)

  
  综上还有一点就是梳子是不是洗干净了?Tongue

• XYZQ (2016-2-10 14:04:17)

  
  我以前也遇到过类似情况，仅仅将LOADING BUFFER 换了，
  PCR电泳图即变正常了。不加甘 油 ，只用 60% 蔗 糖 做 LOADING 。

• 969 (2016-2-10 14:04:33)

  哦,还有就是在做电泳之前稍微离心一下，转速不要求很高，二三十秒就可以了，再做可能会好点Smile

• duoduo (2016-2-10 14:04:49)

  
  点样孔内是模板DNA，大家认同吗？

• yapuyapu (2016-2-10 14:05:15)

  不好意思，您用的是什么酶？我正在扩增20kbp的东西，分为几个片段，不是很理想。

• 穿越时空 (2016-2-10 14:05:41)

  
  对这个现象的讨论，我想不仅是我，相信其他园友也学到了不少知识，在这谢谢大家的参与了！
  我是做PCR增效剂筛选工作的，所以即使扩增的片段较长，但模型体系较简单，所以用普通的Taq酶及Pfu酶就可以了，它们的比例是2：1.
  你要是扩增长片段，可以买质量好些的聚合酶，记得加上一种具有外切酶活性的校正酶就可以。
  在扩增长片段时，甜菜碱是一个很好的添加剂，一般用量为1.2M，你也可以做梯度。效果很不错的。
  甜菜碱一般的生物公司应该有卖的，Sigma也有，大概1000+吧

• chengjie79 (2016-2-10 14:05:57)

  
  产物条带的拖尾现象是否与上样量过大有关系？marker也是如此，有挂壁现象。跑在产物带之前的背景带是不是扩增的不完整片断，或者是杂质没有除干净？加样孔中的一定是大分子，我扩的时候也经常见到，正在想办法解决，望高人指点。