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质谱沙龙第三十六期活动报道

2012.7.24

　　2012年7月21日下午，第三十六期质谱沙龙活动在北京市朝阳医院职业病与中毒医学中心如期举行。来自北京朝阳医院、北京大学人民医院、AB SCIEX公司、中国科学研究院、北京安定医院等二十余名专家、学者、技术工程师参加了本次沙龙活动。本次沙龙涉及生物分析、代谢组学、小分子定性、小分子定量、大分子的应用等方面的内容。

第三十六期沙龙活动现场分享与倾听

首都医科大学附属北京朝阳医院职业病与中毒医学中心李惠玲

　　李老师首先对北京朝阳医院毒物化学分析实验室做了简单的介绍，其次介绍了ICP-MS同时测定全血中多种元素的方法。

北京朝阳医院毒物化学分析实验室介绍

　　北京朝阳医院毒物化学分析实验室从2005年开始建立并运行。希望通过沙龙扩展在毒物化学与分析方面质谱应用的新的思路。

　　目前毒物化学分析实验室配备的仪器有GC-MS、ICP-MS、原子吸收分光光度计、原子荧光光度计、紫外-可见分光光度计、微波消解仪等先进的仪器、拥有比较完善的专业队伍。在国内的综合性医院中，朝阳医院的硬件和检测水平位居前列。朝阳医院毒物化学分析实验室可以满足北京地区各级医疗机构和患者毒物检测的需求，并同时承担国家和北京市突发化学品中毒临床救治任务。实验室日常的毒化检测项目包括六个方面：生活中毒、职业接触、意外接触、治疗用剂、代谢疾病的检测、微量元素的检测。检测的化合物包括33种农药类和4种鼠药类物质。

ICP-MS同时测定全血中多种元素

　　李惠玲老师作了题为“血清中21种元素的直接进样动态反应池ICP-MS测定”的报告，主要从样品前处理方法、进样方式、内标物、基质、DRC条件的选择的几个方面介绍了ICP-MS同时测定全血中多种元素的具体方法。

　　在现代医疗临床及研究中，人体中的微量元素越来越成为人们关心的焦点了，通过血液中元素的检测可以为相应疾病的诊断治疗提供依据。目前广泛用于人体血液中元素检测的仪器主要有原子吸收光谱、ICP-OES，前者由于有相关的行业标准，检测的应用比较多，但检测速度慢，并不适合做多元素同时检测。后者对于有些元素的检测灵敏度比较低，不适合做痕量元素的检测。

　　样品前处理方法的选择

　　采用简单的硝酸溶液稀释法，将样品稀释后进样检测。实验发现当硝酸浓度大于1%，会造成全血样品中蛋白质破坏产生沉淀，因此采用1%硝酸溶液作为稀释剂。

　　进样方式的选择

　　为了操作方便并考虑到在线内标加入具有一定的稀释比例(样品进样采用内径为0.38mm的泵管，内标采用内径为0.76mm的泵管，相当于3倍稀释)，采用1.5mL的离心管作为容器，分别用微量移液器移取0.5mL待测血清和1.0mL1%硝酸溶液摇匀测定。

　　内标物的选择

　　对于质量数小于80的元素，李老师在初期设计了采用Sc的内标物，但在实际工作中发现即使是在纯水溶液中，⁴⁵Sc的离子计数也达到了8000-10000cps，同时在实际血清样品的检测中，离子强度变化较大，样品中Ca、Si等元素含量的不同将导致内标强度的稳定性变差，最后确定了使用Rh作为内标元素，并根据强度的大小将浓度定为2ug/L。对于质量数大于100的元素，考虑的不仅需要内标元素，最好还能消除Hg的记忆效应，因此最后采用Au作为内标元素，浓度为2ug/L。

　　基质的选择

　　适当浓度的有机溶液对离子的检测具有增敏作用，从实际操作简便性及使用成本考虑，采用无水乙醇作为有机溶剂。样品中也含有大量的有机物，因此通过高浓度的有机溶剂加入可以将标准溶液和样品大致做一个基体匹配，通过实验最后确定乙醇的浓度为2%。

　　干扰的消除及动态反应池(DRC)条件的选择

　　对于一些元素或离子的检测存在大量的干扰，在实验过程中采用DRC技术消除干扰离子。在DRC中，通入选定的反应气体，气体与干扰离子进行化学反应滞后其质荷比将会发生改变，由此通过四级杆的质量过滤功能将其消除。

北京大学人民医院赵立波

　　北京大学人民医院药剂科的赵立波老师的报告的题目为“代谢组学研究简介及Qtrap用于代谢组学的初步探索”，主要介绍了代谢组学研究的简要情况和Qtrap用于糖尿病代谢组学研究的初探。

　　代谢组学的基本概念

　　代谢组学研究的对象是一些代谢产物，这些代谢产物以元素组成、院子排列、立体结构和分子结构来区分，检测代谢产物的方法就各不相同。代谢组学是“组学”研究的最终方向，对生物体的代谢情况提供一种由全局向细节的研究思路，是基因组学和蛋白组学的延伸乃至它们在代谢层面上的集合。

　　代谢组学各分析流程技术包括样品的提取、样品预处理、化合物的分离、检测及鉴定、数据分析与可视化、建模与仿真。

　　代谢组学的研究方法中对于单个细胞或细胞类型的小分子成分采用GC、LC、CE-MS的方法进行分离、检测与鉴定，而对于生物体液和组织进行系统测量和分析时需要采用NMR的方法。这两种分析技术各有优势，前者有较高的灵敏度和缴款的动态范围，但是检测较费时且样品前处理的过程较复杂。后者具有无损伤性、无偏向性的、良好的客观性和重现性、能够高通量检测的优点，但是灵敏度较低，动态范围有限。

　　Qtrap用于糖尿病代谢组学研究的初探

　　2型糖尿病(DM)是人类最主要的致残和致死因素之一，病因呈高度异质性，受遗传、环境、行为等因素的综合影响。作为一种代谢综合征，糖尿病很难用单一的评价指标和发病机制来反映其发生及变化，同时检测多成分的代谢组学，可以作为研究的手段之一。国外研究发现脂肪酸、色氨酸、尿酸、胆汁酸、溶血磷脂胆碱含量变化有着显著性变化，被认为是2型糖尿病的特征性变化，为如何鉴定漫长且无症状表现的2型糖尿病前期提供了一种有效的方法，对该病早起的诊断和预防有着重大的意义。国内也有大量研究表明甘油三酸酯、脂肪酸和乙酰乙酸这三种小分子代谢物的含量变化具有显著性差异，可能成为糖尿病诊断的潜在生物标记物。

　　目前已有的糖尿病代谢组学质谱分析方法具有一定的局限性，研究对象只能是n<50的临床小样本，研究方法缺乏充分证据。

　　赵老师讲到，人类已知的小分子代谢物大约有2500种，能被常规仪器检测的大约有1200种，但无法确定其所有的结构;目前国际一流的代谢组学实验室通常能一次性在一个生物样本中同时鉴别出400-600个内源性代谢物。

　　仪器日内与日间精密度的考察

　　赵老师选择可检出的15种标准物质与2种内标进行精密度的考察，配置混合溶液1/3MIX、1MIX、3MIX，40℃氮气流吹干，用健康人尿液复溶，漩涡振荡10min，转移至EP管13400rpm离心10min，取上清过0.22um水系滤膜，进行质谱分析。分别采用+EMS、-EMS方法检测。结果用MarkerView进行提取，采取外标法与内标法分别进行计算，得到的数据进行日内与日间精密度的计算。

　　讨论

　　代谢组学研究的对象是相对分子质量1000以下的内源性小分子化合物。人体中各类内源性小分子代谢物有上万种，各种代谢物的浓度范围和物理化学性质差异很大。目前没有一种分析技术对机体中所有的代谢物进行分析。

　　人类已知的小分子代谢物约有2500种，能被常规分析仪器检测到的大致有一般，但尚无法确定其所有的结构。

　　近年来NMR、MS与多种分离手段联用成为代谢组学中的重要分析工具，目前世界上较好的代谢组学实验室通常能一次性在一个生物样本中同时鉴别出400-600个内源性代谢物，可见代谢组学分析测定方法学还有很大的上升空间。

　　关于Qtrap应用于代谢组学的方法学研究，近年来有少量报道。已有的研究均没有体积LS-MS方法的日间变异，也没有选用合适的内标对变异的进行校正，仅仅用于小数量生物标本的测定，难以满足大样本研究的需要。

　　赵老师的研究建立了一种基于三重四极杆-线性离子阱杂交质谱技术的代谢组学分析方法，着重对该方法的变异性进行了论证。在选定的色谱质谱条件下，15种内源性代谢物的日内变异小于20%，而日间变异较大，内标的运用对变异的控制无明显改善。LC-QTRAP应用于代谢组学生物标志物的筛选还有很大的改进空间。

　　代谢组学是一种半定量的研究方法，注重的是对所有代谢物的检测及其峰强度的比较。赵老师的研究是将低、中、高三种浓度的标准品与健康人尿样混合作为模拟生物样品，检测结果可为代谢组学生物样品的检测提供合理的评价。由于日间变异较大，进行代谢组大样本检测时，分析得到的生物标志物必须通过其他方式进行验证。