新技术显著提高CRISPR系统精确性
麻省总医院的研究人员开发了新一代的基因组编辑系统，可大大降低生成不必要的、脱靶基因突变的风险。在发表于《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上的一篇论文中，作者们报告称，一种新型的基于CRISPR的RNA引导性核酸酶技术通过利用两条引导RNAs，大大降低了在错误的位点切割DNA链的机会。
论文的资深作者、麻省总医院病理科研究副主任J. Keith Joung博士说：“这一系统不仅增强了广泛采用的CRISPR/Cas系统的易用性，并通过一种二聚化作用依赖性的核酸酶活性赋予了更高的作用特异性。较高的特异性是未来临床应用这些核酸酶的必要条件，我们描述的这类新蛋白有可能为治疗基因组编辑提供了一个重要的选择。”
基因工程CRISPR-Cas核酸酶是由一种叫做Cas9的DNA切割酶，和一段与靶 DNA片段匹配的20个核苷酸长度的短RNA片段所构成。它模拟了某些细菌的原始免疫系统。当这些微生物受到病毒或其他生物体的感染时，它们会拷贝入侵者的一段遗传密码，将它插入到自身的DNA中，并传递给细菌后代。如果在未来遇到相同的病原体，细菌的Cas9在与拷贝DNA片段匹配的RNA序列的引导下，通过在靶位点切割病原体的DNA而灭活它。自2012年首次开发出CRISPR-Cas核酸酶这种基因组编辑工具以来，科学家们针对它开展了很多的相关研究。
相比于早期的ZFN(锌指核酸酶)和TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)系统，CRISPR-Cas核酸酶更易于使用，其已在几种动物模型系统和人类细胞中诱导出了基因组改变。在以往发表于2013年6月的一篇Nature Biotechnology论文中，Joung研究小组报告称CRISPR-Cas核酸酶可在人类细胞中生成另外一些突变，如果DNA片段与靶DNA片段的差异在5个核苷酸以下，就会出现脱靶突变。
为了解决这种状况，研究人员开发出了一个新的平台将Cas9的靶向功能与一种叫做Fokl的特征明确的核酸酶相融合，只有当两个拷贝的RNA分子配对发生二聚化时Fokl核酸酶才会发挥功能。这种改变使得这些新型的CRISPR RNA引导的Fokl核酸酶(RFNs)所识别切割的DNA长度增大了2倍，大大提高人类细胞中基因组编辑的精确性。重要的是，Joung和同事们还证实，这些新型的RFNs能够像现有的、靶向较短DNA序列的Cas9核酸酶一样有效地进行靶向修饰。
“通过将识别DNA序列的长度增大2倍，我们开发出了一类新的基因组编辑工具，相比于现有的野生型Cas9核酸酶和切割DNA单链的核酸酶切酶大大提高了精确度，”Joung说。该研究小组还开发出了能够让使用者鉴别出这些RFNs的潜在靶位点的软件，将这种能力整合到了可免费获取的一种软件包ZiFiT Targeter中。
此外不久前，Joung研究小组还在另一篇Nature Biotechnology杂志上发表论文称，通过将引导性RNA的长度稍加调整，也能大幅减少预定目标之外的DNA突变。与全长gRNA相比，一些位点的突变频率甚至减少了5000倍以上。重要的是在靶向预定目标DNA时，缩短了的gRNA与全长gRNA同样有效。
