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【求助】western背景总是很深
【求助】western背景总是很深
我最近做western,用碱性磷酸酶标记,可是染色后背景总是很深,我用含5%脱脂奶粉的TBST,是不是我的脱脂奶粉有问题啊?不知各位都用什么牌子的脱脂奶粉,我用的是伊利高蛋白高钙脱脂奶粉.是不是高蛋白影响啊?看见有进口脱脂奶粉卖的很贵,100克要300元.而且还有杂带,我降低了二抗浓度,没有结果,而且背景依然还有.请各位帮帮忙!谢谢!
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最新回复
plaa (2014-6-18 17:07:42)
方法：
1.二抗浓度是最主要的，再降低二抗浓度。你说你降低了，那么再降！！不要怕降到推荐浓度下
2.延长一抗、二抗后洗膜时间，可以尝试 15min*4
3.减少曝光时间
4.封闭可用更高浓度的牛奶，15%都可以，我自己用的是光明牌的，效果很好，比公司卖的Western专用封闭液也不差哪去
bamboo16 (2014-6-18 17:08:03)
主要是封闭的问题
我一般是5%脱脂乳封闭一夜!!效果不错
不知道你的实验条件是怎么样的
any333 (2014-6-18 17:09:39)
降低抗体孵育时间，降低一抗／二抗浓度．同时提高封闭时间．
wawa (2014-6-18 17:09:56)
我们用的脱脂奶粉和你用的是一样牌子的！没有问题！一般背景很深应该是封闭的问题！
wawa (2014-6-18 17:10:16)
但是 我们封闭过夜和2小时都做了都很好 ！
xyw5 (2014-6-18 17:15:05)
封闭用光明牌的,的确不错,价格便宜,量又足,我一直用它.5%
#问号# (2014-6-18 17:15:50)
谢谢各位帮忙！我一般4度封闭过夜，可还是背景深。我再降低一下二抗的浓度看看，由于我们还没有建暗室，我用碱性磷酸酶标记，我的显色液是买的天为的BCIP和NBT，不知有没有可能是显色的问题？请教各位暗室应该怎么建？我们正准备建可是不知用什么材料和具体要求，请各位指点一下，谢谢！
plaa (2014-6-18 17:16:14)
#问号# (2014-6-18 17:16:32)
谢谢各位的帮忙，我做了几次总有两条杂代出现，我用的是santa cruz的一抗，蛋白是tubulin，不知有没有人做过，能不能是抗体的问题？还是蛋白本身由于自身的结构容易出现杂代？
bring (2014-6-18 17:16:52)
背景深主要有两个原因，一是封闭不足，我们实验室常规是5－10％脱脂奶粉室温封闭3小时或4度封闭过夜。另一个问题就是洗膜不充分，如果封闭、一抗、二抗的原因你都注意了，但是背景还是很深，就应该适当增加洗膜液中的盐浓度或洗膜次数，我们实验室洗膜液中NaCl是500mM，一抗作用完毕后洗膜20min，二抗作用完毕后洗膜35min，背景非常干净。
lxh031 (2014-6-18 17:17:21)
洗得不完全吧，背景都是非特异性的结合
一抗，二抗都要用封闭液进行稀释
hustwb (2014-6-18 17:17:46)
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可能跟抗体有一定关系吧？我们实验室做的是α－tubulin，从sigma买的，从来没有杂带，推荐1：5000，用到1：10000还是相当的好，条带亮且单一。
#问号# (2014-6-18 17:18:16)
谢谢各位帮忙，刚才看了个帖子，是不是与二抗标记有关，我二抗是用碱性磷酸酶标记的，我做的背景深不知与这有没有关系？而且我用变性胶跑得，应该杂交后分子量应与单体的大小相当，可是我做的蛋白大小却与二聚体的大小相似，不知是何原因？又要麻烦各位了！
#问号# (2014-6-18 17:18:45)
这是最近做的持家蛋白tubulin试验照片，比以前好一些，但还是有一些杂带，而且预染marker带（天为）总是比较宽，不知什么原因？请各位帮忙！
18891064.snap.jpg
#问号# (2014-6-18 17:19:02)
一抗santa cruz，二抗santa cruz（碱性磷酸酶标记），5％脱脂奶粉封闭过夜，一抗1:250孵育1小时，TTBS洗三次，每次10分钟，二抗1:2500孵育2小时，TTBS洗三次，每次10分钟。显色（天为BCIP/NBT试剂盒）。右边第一条带预染marker，右第二条普通marker，立春红染色。预染marker跑了几次总是这样，是不是marker有问题啊！
ROSE李 (2014-6-18 17:19:23)
8princess8 (2014-6-18 17:19:43)
#问号# (2014-6-18 17:20:06)
谢谢各位的指教！那怎么办？它也出带难道真是抗体的问题？还有预染marker怎么带这么粗？santa cruz的抗体很差吗？我看文献都用这个公司的，再摸摸条件不知能行吗？
fei1226com (2014-6-18 17:20:28)
兔唇 (2014-6-18 17:21:10)
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1）一抗使用浓度太高了，如Santa的抗体还是值得信赖的，至少可以1：500稀释，建议你1：800稀释使用一下试试
2）二抗1：2500稀释没问题，时间只需1h足矣
3）封闭该用10％脱脂奶粉，时间1h足矣，我做过对照，封闭1h和过夜基本上没区别。封闭后加水将剩余的10％奶粉稀释成5％，然后加一抗、二抗孵育
4）预染Marker质量太差了，我用过天为的东西，质量确实不敢恭维，价格也没优势，推荐使用MBI的预染Marker，2×250 ul，不到300元，5ul/反应上样，算下来比国产的还便宜，关键是条带很清晰
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