【求助】关于浮游动物DNA条形码的实验

最新回复

• xuuuu (2014-9-26 18:14:05)

  
  从图看蛮好的效果啊，为什么怀疑不能做回收纯化呢？

• zhy平平 (2014-9-26 18:14:29)

  QUOTE:

  原帖由 xuuuu 于 2014-9-26 18:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  从图看蛮好的效果啊，为什么怀疑不能做回收纯化呢？

  我做过一次，回收不了成功，据说回收纯化要损失部分DNA，所以我很想直接拿出去测序，可是别人又说直接拿去测序的话，pcr的产物需要一定的浓度要求啊。

• caihong (2014-9-26 18:14:52)

  如果要测序的话，建议扩增50微升的体系送测。因为浓度有些低，需要的体积要大些。另外，你的胶跑得并不理想，跑胶缓冲液和配胶要用1XTAE，而不是用水。
  

• zhy平平 (2014-9-26 18:15:14)

  QUOTE:

  原帖由 caihong 于 2014-9-26 18:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  如果要测序的话，建议扩增50微升的体系送测。因为浓度有些低，需要的体积要大些。另外，你的胶跑得并不理想，跑胶缓冲液和配胶要用1XTAE，而不是用水。
  ...

  我的缓冲液和配胶也是用1XTAE的呢，唉，这已经是好一点的了，我用更小的浮游动物pcr产物跑出来的是这样的条带。我的pcr体系也是50微升。

• hold住 (2014-9-26 18:15:28)

  
  回收以后与T载体连接，将质粒送测序

• yueban-1147 (2014-9-26 18:16:12)

  
  楼上正解，连T载只要很低的浓度就可以。

• junjie05 (2014-9-26 18:16:35)

  
  直接测吧 肯定可以

• toy (2014-9-26 18:16:57)

  如果胶回收不成功，或者是损失太多，建议直接PCR产物过柱纯化一下就可以了。

• greenbee (2014-9-26 18:17:13)

  应该是可以继续的。可以切胶

• any333 (2014-9-26 18:17:40)

  
  看了一下圖個人的建議是
  
  1.膠中的產量有點少,PCR cycle數如果可以的話跑多一點,但不要超過34 (點突變發生率會增加很多)
    如果時間許可PCR condition可微調一下 (denature時間/annealing溫度/extenstion時間)
  
  2.回收膠中的產物後 最後從 column回溶的體積少一點,雖然說明書上應會建議回溶50uL的體積,但產物不多的情況   下會有測不到核酸濃度的窘境 因此個人會放個7uL扣除誤差最後回收5uL
  
  
  
  3.回收完後就跟6樓說的一樣 接TA vector 挑菌後送菌液定序(primer用M13 forward and reverse),如果你有設計   restriction enzyme cutting site 可在送定序前切,看看產物位置是否正確
  
  
  4.在產率不高的情況下不建議直接送定序,elution後濃度太低廠商也無能為力
  
  
  個人微不足道的經驗 希望能助你能戰勝cloning這門很玄的學問

• okhaha (2014-9-26 18:18:00)

  想胶回收，可以多做几管点到一起，回收的量就会很大，再进行后续的实验一点问题都没有。

• pengke1983 (2014-9-26 18:18:21)

  直接测吧 肯定可以
  
  同意楼上，直接割胶回收送测序就行，浓度大于10ng就可以的，但是还是以跑电泳看见条带为准。

• bojitu (2014-9-26 18:19:06)

  
  直接测，不用回收！亮度可以的！我的比你的浅都测出来了

• TNT (2014-9-26 18:19:23)

  有的公司会提供割胶回收的服务，好像也不用加钱 直接给说要多大的带就行啦

• bohe221 (2014-9-26 18:19:41)

  
  跑25微升体系，2微升跑胶看一下，剩下的可以直接送去测序。
  
  不知道LZ选用的是核基因还是其他位置的。我以前做过条形码最初的实验，这个有拖带的情况，很可能是杂合的。而且单一明亮条带，杂合的可能性也比较大。如果杂合就不能用。。。LZ心里做好准备吧。