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【求助】荧光定量PCR的CT值太高
小弟最近在做荧光定量PCR,发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高(30多),目的基因30多也就罢了,actin不会这么高啊! 我先后做过以下调整:【求助】荧光定量PCR的CT值太高
1、增加模板浓度,稀释10倍、5倍、2倍,不稀释的都试过,没有什么质的变化
2、增加引物浓度,做了一个梯度,发现变化也不大
3、怀疑是逆转录试剂盒不行,换了另一个进口试剂盒(promega)还是老样子
4、重新测了一下提取的RNA,浓度和纯度都可以(A260/280=1.9左右
5、引物blast了,很好。溶解曲线也是单峰,Tm在90左右。
6、操作应该不会有什么大的失误
现在实在不知道哪里出了问题。。。。求各位高手帮我想想是哪里出了问题
我的体系如下:10ul 染料(Go Taq Mix,promage公司)、2ul cDNA(不稀释)、上下游引物各0.4ul、补水至20ul
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最新回复
铜雀 (2015-7-03 11:09:05)
发现一个问题,溶解曲线虽然是单峰,但是纵坐标的Rn的值很高,别人的都是小于0.1,我的1-5. 是不是这个原因啊?
langlang (2015-7-03 11:09:19)
你actin的产物预计是多少bp?跑过胶看看没?
建议换一对引物。
铜雀 (2015-7-03 11:09:39)
QUOTE:
好像是200 bp左右,没有跑过胶,我试试看吧shkudo (2015-7-03 11:10:01)
QUOTE:
200bp对于Real-time PCR太大了,一般来说是几十个bp最合适。个人认为还是引物的问题。另外不排除RNA提取过程和逆转录过程中DNA的污染,建议先用DNAse处理后再进行逆转录。
daod (2015-7-03 11:10:24)
QUOTE:
建议先进行普通的PCR,用actin鉴定模板的质量。循环数设在22-26之间,跑胶后,看ACTIN的表达情况,再分析原因。luoliqiong (2015-7-03 11:10:42)
whitesheep (2015-7-03 11:11:09)
个人感觉cDNA模板和引物应该没有问题。难道是荧光定量PCR的机器坏了?我用的是AB7500.
各位大侠实验室的荧光定量PCR机器多长时间维修一次?
68476585.jpg
ns5fan (2015-7-03 11:11:28)
铜雀 (2015-7-03 11:11:49)
QUOTE:
第六和第七道我没有加样啊。请问是如何看出引物有问题呢?bring (2015-7-03 11:12:05)
有可能是RNA降解的原因,建议将RNA跑个电泳看看。
ending (2015-7-03 11:12:23)
奥,呵呵,我以为你actin 4个也对应着有4个目的扩增片段哪,呵呵
qqq111 (2015-7-03 11:12:39)
请问各位大侠做实时荧光定量PCR,你们的模板cDNA 10微升体系的,一般稀释多少呢?还是要自己摸索啊
woshi (2015-7-03 11:12:57)
做实时荧光定量PCR最好不能低于20ul体系,不然荧光信号不稳定。
铜雀 (2015-7-03 11:13:24)
QUOTE:
引物特异性差,重新设计引物,多设计几条xyw5 (2015-7-03 11:13:44)
从图上看产物的量很多。
你可以在PCR扩增过程中取样跑电泳,即不同循环下取样或取一管。
从电泳中就可以看出来是大致是哪个循环下就出峰了。(相当于用普通PCR仪做定量)
如果比较早就出峰,可能是你的Sybr有问题或管有问题(管盖不够透明之类的)或是仪器光路系统有问题等
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