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【求助】如何扩增启动子序列?
我的实验中需要用PCR法扩增一段启动子序列,该段序列包含很多顺式作用元件,GC含量很高,达75%以上。【求助】如何扩增启动子序列?
努力了一个多月,未得到任何扩增产物(假阳性都没有),唉~~~~~~怎一个郁闷了得。
我已做了以下工作:
1. Taq酶:最初用的是高保真酶,没结果,有位博士指点:高保真酶效率低,且贵,建议用普通Taq酶摸索条件;改用Taq酶仍没结果;现在用的是宝生物的LA Taq(因其含有GC Buffer)仍……
2. 引物:引物是自己根据文献报道的DNA序列用DNAstar设计的(文献中没有现成的引物)。开始用的是上海生工合成的,没结果,后来因对该段序列不满意,重新设计了引物,上海申能博彩合成的,还是……
3. Mg2+浓度:设定了各种梯度,结果同上。
4. 模板:有一位高手(博士)帮我重新抽提的大鼠基因组DNA,并经反复纯化,应该没问题吧。可是PCR有问题。PCR前我还把模板作了变性处理——100℃10min然后冰浴。结果同上。
5. 我还使用矿物油、DMSO、GC Buffer,结果同上。
6. 反应条件:变性温度——94℃、95℃,时间——30sec、45sec、60sec
复性温度——55℃、52℃、50℃、48℃、60℃,时间——30sec、45sec、60sec
延伸温度——72℃,时间——1min、2min
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【求助】如何扩增启动子序列?
【求助】如何扩增启动子序列?
最新回复
笑弯了腰 (2016-3-01 11:15:47)
另外,我怀疑启动子序列因其结构复杂,如设计引物时不易避开二级机构区等,导致其不可能用PCR法进行扩增。如果真是这样我就不要再做无用功了。如果有哪位战友曾扩增过启动子,请回个帖,给兄弟一点指点和信心。
再没有进展,毕业就成问题了,请各位走过路过的朋友都谈谈,给点建议,帮兄弟一把,谢谢了先。
TNT (2016-3-01 11:16:03)
你确定基因组DNA是好的吗?最好用另外无关的引物作一下阳性对照。另外,如果你要做下一步的工作,应该预留酶切位点吧。
笑弯了腰 (2016-3-01 11:18:18)
酶切位点在设计引物时已经预留了。
其他还有什么建议,也请谈谈。
非常感谢!
xue258 (2016-3-01 11:19:37)
既然GC含量这么高,为什么不试一下某公司推荐的专门用于扩增高GC含量的TAQ酶和buffer?
DNA (2016-3-01 11:19:57)
完全理解兄弟你的郁闷,我最近刚作了6个基因的2KB的启动子PCR,如你所言,刚开始一个多星期非常之郁闷,可是目前结果已经全P出来了,一点经验,希望对你有用 !
1。Taq酶就普通的即可,首先你要做的是跑个温度剃度,范围可以大一些,我们一般是16个的一起跑,8个一排,其中4个不加任何添加剂,另4个间隔加DMSO(8%),第二排4个加甘油,还有4个加甲酰胺(浓度为4%)
2。一般情况下上面是有1个可以做出来的,如果不行,可以用降落PCR,从70度开始,每个cycle降落0.5度,做18个cycles,最后用你的退火温度18个循环,辅助试剂都要加的
good luck
注:我跑的GC达到76%
PINK (2016-3-01 11:20:17)
不知你的引物设计如何。
我曾p过启动子。
引物比一般引物长,35个bp。
就用普通PCR的方法,不过结果p出的条带较弱。
ququer787 (2016-3-01 11:32:30)
此人电子邮件为:
ladyhuahua (2016-3-01 11:33:07)
不知现在做得怎么样了?谈谈你的体会和经验,多谢先
any333 (2016-3-01 11:36:57)
请问做出来了吗?有什么心得体会?跟大家讲授讲授
any333 (2016-3-01 11:37:14)
我最近用PCR法扩增了一段启动子序列,谈点体会供参考
1)采用多重PCR
2)用了LA酶或KOD-PLUS
3)8%DMSO+5%甘油
4)基因组DNA的加入量:1-10ng
woshi (2016-3-01 11:38:05)
我现在正在做Streptococcus gordonii(戈登链球菌)rgg/IgG启动子的PCR,我设计的引物为:
上游(F): 5'-CGCGGATCCTTTTATTGACGGAGATTAGC-3'
下游(R): 5'-CGCCTCGAGATTGGTCACTTGATTAGC-3'
其中能与模板连接的部分是CTTTTATTGACGGAGATTAGC和ATTGGTCACTTGATTAGC,其余的部分是酶切位点和保护碱基。
从NCBI找的这段基因的序列见附件。
请问我的引物对扩增这个启动子是否合适?我的扩增程序应该怎么设计?
因为我用退火温度60℃和58℃一直没有P出来。
笑弯了腰 (2016-3-01 11:38:32)
我现在已经得到了大小相符的条带,但条带很淡,回收后量太少,没法直接测序鉴定.准备用T-载体连接,大肠杆菌扩增后测序,但是目前实验室T-载体出了问题,大家都连不上去,已经订了新的T-载体,就快到货了.
我用的是LA酶和配套的GC buffer.
反应条件:变性温度——94℃(首次为95℃),时间——1min
退火温度——56℃(比引物的退火温度低10℃),时间——1min
延伸温度——72℃,时间——2min
上下游引物长度分别为30和29bp
根据上述反应条件进行实验时,结果并不稳定,多数情况下没有条带或条带太淡,没法回收,十次实验能得到较亮的可以回收条带的次数不超过两次。可能反应条件还需要近一步优化。
体会是PCR反应太不确切,付出极大努力,回报却很难令人满意。我已近乎绝望。以后做实验能不做PCR则绝不做PCR。
【求助】如何扩增启动子序列?