【分享帖】基因启动子区 甲基化引物设计心得

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• bs4665 (2015-7-02 09:23:54)

  
  不好意思，问一个弱智问题，什么软件可预测基因的启动子？本人一菜鸟，刚接触，希望多多了解！还有设计MSP,BSP引物也要根据启动子序列吗？谢谢！

• 园丁## (2015-7-02 09:24:46)

  启动子区的序列依据上述方法可以调出，但其中真正发挥作用的部分，即顺式作用元件，还要用专门的软件进行预测和实验验证。MSP,BSP都是研究甲基化的PCR衍生技术，启动子甲基化与基因表达密切相关，所以研究甲基化基因表达调控的一般选择启动子CpG序列进行研究。当然，如果是研究肿瘤诊断用甲基化标记的，不一定局限于启动子，关键是甲基化改变与肿瘤的相关性。
  本人尚不会发图片，问题说的不清楚。请战友谅解。一定继续努力，好好学习，天天向上。

• veiwu (2015-7-02 09:27:25)

  aifuhong:我做IGF-1启动子区域的737/738位点的CA重复序列的PCR,但是我在基因库里怎么都找不到这个区域的核甘酸序列,你能帮我么?cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=10498928&sty=1')

• veiwu (2015-7-02 09:41:47)

  难道是硬在基因序列上找TATAAT这个特征序列么?然后按25个bp再推启动子区域么?

• dior (2015-7-02 09:42:07)

  请说明物种,人的还是其它的?文献报道的有引物序列吧. Blast或电子PCR一下,可以调出序列的. 据你提供资料,应为一个STR 微卫星位点.不知道你的研究目的是什么. 如要区分2bp的差异, 用普通PAGE有困难, 技术高点尚可以. 用ABI3130应该没有问题.但重复单位为2bp, 扩增时也容易出问题, 发生酶滑脱,形成非特异性的stutter带或峰,分析结果时应注意.

• veiwu (2015-7-02 09:42:34)

  
  谢谢！是做孕妇的,具体说是做脐血请原谅我知识匮乏,ABI3130具体是指什么样的方法?这个片段的等位基因型就是表达192个bp,如果我的目的只是弄清是此等位基因的纯合型、杂合型还是缺失型用什么分析产物的方法好呢？既简单又好的？

• 园丁## (2015-7-02 09:42:52)

  
  ABI公司的毛细管电泳系统。抱歉。还是看不明白你研究什么目的。纯合型、杂合型、缺失型的差别在什么地方？不同等位基因间是重复单位重复次数差异（长度差异），还是插入、缺失型的变异位点。是DNA水平研究变异或突变？还是研究基因表达，在mRNA水平？

• 阿k (2015-7-02 09:43:09)

  
  我也是刚刚接触甲基化，想问一下搂主有没有听说过这个软件ESME，好像可以做出附件中的图，这个图在很多国外的研究甲基化的文献中都有，如果用过请指点，还想问一下，您做甲基化是如何进行分析的，是克隆测序算出甲基化率进行再比较高甲基化低甲基化吗？谢谢！

• woshi (2015-7-02 09:43:29)

  
  你好！我想研究一个未知基因的DNA甲基化情况，想用MSP或BSP法，之前设计的引物扩增不出来，所以想请问你是用什么软件设计的MSP或BSP的引物的？谢谢！

• 园丁## (2015-7-02 09:43:52)

  
  cuturl('www.methdb.de')
  推荐战友们访问此网站，以及此网站提供的一系列甲基化相关工具网站的连接，有帮助于解决上述战友的问题。

• 园丁## (2015-7-02 09:44:06)

  
  在当前国内浮躁的学术环境下，我不认为有几个人可以耐心的去设计优化出一个针对特定位点的MSP甲基化分析系统。即使国外设计好的MSP系统，其稳定的运行，得出有意义的科学的数据，不但需要严谨的精神，高额的耗费，而且需要高超的实验技术。MSP的难度，最好是普通PCR具备相当基础后再涉足此领域。BSP难度稍低点，也仅仅是比MSP稍低了点。占有们应有足够准备。
  我实验引物多用在线软件Methprimer设计。
  BSP测序数据用BiQAnalyzer分析。该软件下载安装后使用，需要JAVA。
  二者均可从cuturl('www.methdb.de')找到连接。

• caihong (2015-7-02 09:44:51)

  
  楼上，我做了个基因的BSP，运气比较好，目的基因出结果了，送去测序，但不知道如何分析测序结果，不知有没有什么软件分析的，还有测序图如何看

• caihong (2015-7-02 09:46:13)

  
  楼上，我做了个基因的BSP，运气比较好，目的基因出结果了，送去测序，但不知道如何分析测序结果，不知有没有什么软件分析的，还有测序图如何看，请教了

• 园丁## (2015-7-02 09:46:31)

  
  是BSP产物直接测序,还是克隆后测序? 两者的意义是不同的. 我做的是克隆后挑单克隆测序. BiQAnalyzer分析。该软件下载安装后使用，需要JAVA。
  可从cuturl('www.methdb.de')找到下载连接。

• remenb (2015-7-02 09:52:17)

  
  aifuhong ,我是BSP产物直接测序，请问如何看测序图

• 园丁## (2015-7-02 09:58:33)

  
  BSP产物直接测序 测的是许多甲基化情况不同的分子的混合体, 就我所知, 目前还没有专门针对此结果分析的软件. 需要自己对公司交付的测序图( 电子版的用测序结果的看图软件打开)进行分析, 看原来CpG位点是C还是T, 亦或者是C/T双峰, 及双峰高度的相对比例, 作出人工的CpG位点甲基化情况判断.

• 园丁## (2015-7-02 10:08:11)

  下面是本人博士论文中对直接测序结果分析的描述:
  将测序结果去除引物，用在线程序MethBlast粗略分析与目的序列的同源性和甲基化情况，然后人工分析每个CpG二核苷酸位点的测序峰图，判断有无甲基化及其大致比例。本法依赖测序峰来识别甲基化和非甲基化，对样品中的低水平甲基化可能无法反映出来，也无法获得混合组织中少数异常细胞的甲基化谱。
  附图说明一个CpG二核苷酸位点为双峰, 说明在该位点部分分子为甲基化,部分分子为非甲基化,

  
  43158085.jpg

• 园丁## (2015-7-02 10:11:18)

  
  甲基化研究的方法问题, 至今缺乏稳固的根基. 即使公认的可以接受的方法, 仍然 经不起严格的考问. 这也就是美国人较浪漫的欧洲人较少研究甲基化的原因.
  对于 MSP法, 95%和5%的甲基化, 结果是没有质的差别的. 个人认为, MSP系统,始终应该伴有质量控制标准品的检测, 即应把完全甲基化和完全没有甲基化的DNA与样品DNA同步处理修饰和扩增, 只有阳性和阴性控制的结果都正确时, 样品的结果才有意义. 测序, 无论是BSP直接法,还是克隆后,对于5%的甲基化或非甲基化都可能反映不出来.

• 园丁## (2015-7-02 10:12:22)

  
  相关疾病：
  MSP首先是一种等位基因特异性PCR技术（ASP），而即使针对基因组DNA的
  ASP技术（如SNP分型），都是非常容易出现假阳性、假阴性的，对反应体系、循环参数、操作等的要求非常严格。MSP引物针对修饰后的3.2碱基组成的基因组设计，又要如你所知的种种考虑，引物的选择余地很小，很难设计出高效、特异的MSP引物。修饰后的DNA又量小质差。所以整个MSP系统就象一根竖在桌子上的筷子。你可以找到那个平衡点，把筷子竖立起来，但一点微风就可以令其倒下。明天你就不一定能重复今天的结果。
  其次，基因组DNA的修饰，转化率95%就是达标的，对于国人来说，甚至是优秀的。如此，对于MSP法结果分析来说，是致命的。5%的非转化，足够MSP显现阳性结果了。顺便说一句，转化率的评价方法本身就是受到质疑的。国人，无论是用试剂盒，还是自配转化试剂，很少有人去考虑转化率的。
  再次，DNA的甲基化修饰，本身就不是绝对的。可以认为，100%甲基化几乎是不存在的。加以肿瘤细胞增殖活跃，基因组复制频频，营养供给不良，甲基化作为有序的耗能过程，其维持能力应是下降的。那怕你用的是单克隆细胞系，细胞之间都有甲基化异质性存在。
  再次，组织特异性是基因组甲基化谱的基本特征，检材往往是多种细胞的混合体。即使是所谓的微切割技术，都是难免有其它细胞基因组污染的。
  说了一大堆，甲基化还是值得研究的，非常有意义的。只是说我们应该以严谨的、科学的方法去研究。在还没有更好的方法时，应以严谨的、科学的态度去分析实验结果。

• xue258 (2015-7-02 10:29:34)

  楼主说了这么多，我想体以下几点：
  1，你说的95％转化（因该是修饰效率），5％的非转化，这些数据从什么地方得出？
  2。楼主说了以上诸多考虑的因素，请问你在实际操作中，有什么心得，比如方便的话，能否介绍一下你们实验室做甲基化，从样本的选择（注意点），引物设计，模板DNA修饰及纯化，鉴定，PCR反应体系各个步骤的体会，供我们学习研究！