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紫外分光光度法测定血清蛋白质（一）
关键词：食品安全检测标准物质 农兽药残留检测 环境监测标准样品 无机标准样品紫外分光光度法测定血清蛋白质（一）
【实验原理】
蛋白质分子中存在着含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，使蛋白质在270～290nm波长范围内具有吸收紫外光的性质，其中酪氨酸的 λmax为275nm，色氨酸的λmax为280nm，苯丙氨酸的λmax为257nm，在此波长范围内，蛋白质溶液的吸收值与其浓度成正比，可作定量测定。由于生物样品中常混有核酸，核酸对紫外光也有吸收，但其峰值在260nm附近，因此可用下列经验公式计算蛋白质浓度。
Lowry—Kalckar公式：
蛋白质浓度(g/L)=1．45A280﹣0. 74A260
Warburg--Christian公式：
蛋白质浓度(g/L)=1．55A280﹣0．76A260
将280nm的吸光度与260nm的吸光度各乘以系数相减后即为接近的蛋白质浓度。A280与A260分别代表光径为1cm时对280nm和260nm的吸光度。
由于蛋白质中肽键的存在，使其在200～225nm远紫外区波长也有光吸收，因此，蛋白质浓度在一定范围内，可用A215、A225值按下述公式测定。
Waddell经验公式：
蛋白质浓度(g/L)： 144×(A215﹣A225)
由于血清中不同类型蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同，所以测定270～290nm波段紫外吸收也会因每个样品中蛋白质氨基酸组成的差异而有较大的变异，因而这个方法不能直接用于血清总蛋白的准确定量。而在远紫外区(200～225nm)的光吸收主要由肽键所致，各种蛋白质具有相同的吸收系数，蛋白质浓度在120g/了仍符合Beer定律，因而．Ressley等人建立起210nm波长下测定血清总蛋白的实用方法，其准确性与双缩脲法和Kjeldahl法间有较好的可比性。
【试剂与器材】
1．0．15mo/L NaCl溶液 精确称取NaCl 8.766g溶于1000mL容量瓶中，用蒸馏水容。 2.蛋白质标准溶液(1mg/mL)准确称取经校正后的牛血清白蛋白用0.15mol/L NaCl
溶液配制成1mg/mL。
3．坐标纸、紫外分光光度计及石英比色杯。
【操作步骤】
1．标准曲线法 取8支试管，按表操作进行。
蛋白质标准曲线的制作
试剂 l 2 3 4 5 6 7 8
蛋白质标准溶液(mg/mL) 一 0．5 1．0 1．5 2．0 2．5 3．0 4．0
0．15mol/L NaCl溶液 4．0 3．5 3．0 2．5 2．0 1．5 1．0 一
蛋白质浓度(mg/mL) 一 0．125 0．250 0．375 0．500 0．625 0．750 1．00
混匀后，选用1cm的石英比色杯，在280nm处以第一管调节零点，分别测定各管吸光度值。以光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制出280nm处血清蛋白质标准曲线。取lmL血清蛋白生理盐水稀释液(应使其浓度在蛋白质标准曲线范围内)，加0．15mol/L NaCl溶液3mL，混匀后，按上述方法测定吸光度值，根据标准曲线查出蛋白质浓度。
2．Lowry—Kalckar公式法及Warburg—Christian公式法 用0．1 5mol/L NaCl溶液将血清做100倍稀释，选用光径为lcm的石英比色杯，分别在280nm和260nm波长两处测定溶液的吸光度(A)。
3．Waddell公式法用0．15mol/L NaCl溶液将血清做1000倍稀释，选用光径为1cm石英比色杯，分别在215nm和225nm波长两处测定溶液的吸光度(A)。
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