分享至
测序平台的读长真的很重要吗？
在EdgeBio，我们一直关注如何提高效率，降低成本，并为我们的客户提供整体上更优质的服务。随之而来的是大量的R&D和新技术开发(NTD)费用。一个很好的例子是我们近期发布的一系列技术白皮书(共五篇)，是关于定向重测序应用的，包括外显子组。您可以在这里找到。今天我将与大家分享一些使用Illumina MiSeq仪器的较长读取(2x250 bp)的经验。理论上说，您可以从单次制备中获得更多的数据，且运行时间的代价最低，然而，它也增加了一些成本。那么，究竟是否值得呢?
我认为答案是“看情况”。对于de novo组装，较长的读取会使情况略有改善，但只是在修剪了大量碱基后。对于基于定位的应用，较长的读取似乎并不能使情况明显改善。我们在MiSeq上运行了2x150 和2x250的大肠杆菌DH10B，并通过一些定位和de novo管道分析了数据。下面是结果汇总及少量的解释。
读取的QC
您可以看到250bp运行中175-200之后的碱基质量明显下降。150bp运行与其他许多HiSeq/ MiSeq运行相似。150bp运行中所有碱基的平均质量分布(36)略高于250bp运行(34)，但两次运行的整体质量不错。
定位/比对结果
| Sample | Reads (M) | Aligned | % Aligned | Pairs | Aligned | % Aligned |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Ecoli-150-BaseSpace | 26.020 | 24.848 | 95.50% | 13.010 | 12.690 | 97.54% |
| Ecoli-150-EdgeBio | 26.020 | 25.727 | 98.87% | 13.010 | 12.726 | 97.82% |
| Ecoli-250-BaseSpace | 18.928 | 18.147 | 95.88% | 9.464 | 8.593 | 90.80% |
| Ecoli-250-EdgeBio | 18.928 | 18.507 | 97.78% | 9.464 | 8.768 | 92.65% |
250bp运行的读取通量较低，但有了较长的读取，总的碱基产量是相同的，甚至更高。Q30碱基的数量几乎是相同的。通量的差异可以归结为运行之间的正常差异，或者意味着我们还没有弄清250bp运行的簇密度数量。随着我们开始为客户提供2x250bp运行，我们将继续优化250bp运行的工作流程。两个读长之间单个读取的定位是相似的，但较长读取的配对定位下降了约5%。
如果您正在开展定向测序，如外显子组，我不认为较长的读取会带来更多的见解，但是对于RNASeq、基因融合检测以及其他需要跨越重复的应用(如De novo组装)，较长的读取将有所帮助。
De novo组装结果(CLC Bio)
| Sample | N50 (Kb) | Max (Kb) | Mean (Kb) | Count |
|---|---|---|---|---|
| Ecoli-150-CLC (UT) | 95.3 | 326.3 | 35.7 | 126 |
| Ecoli-150-CLC (T) | 107.6 | 326.3 | 40.5 | 111 |
| Ecoli-150-CLC (UT-SS) | 95.3 | 326.3 | 35.4 | 127 |
| Ecoli-250-CLC (UT) | 96.9 | 326.3 | 7.9 | 585 |
| Ecoli-250-CLC (T) | 107.6 | 326.3 | 34.9 | 129 |
| Ecoli-250-CLC (UT-SS) | 97.1 | 326.3 | 41.6 | 108 |
UT = Untrimmed T = Trimmed SS = Sub Sampled to 30X
在我看来，这些结果的解释相当直截了当。通过De novo应用的积极修剪，N50(2Kb)有较小增益，且contig数量略有减少。因此，人们应自行决定是否要承担额外的运行时间和试剂所带来的成本，使统计结果略为上升一点。
总结
总的来说，考虑到我们利用MiSeq主要是为了支持开展人类定向重测序的客户，我们仍将建议使用150bp试剂盒。MiSeq和Ion Torrent在该领域的进步是令人兴奋的，但我们必须要立足现实。一些(并非全部)有关这些仪器可扩展性的大肆宣传是来自读长的延伸。
