【求助】5‘RACE 紧急求助

最新回复

• gogo (2015-8-05 09:48:19)

  
  不要管引物单上的温度，第一轮低退火温度扩，我一般55度，40个循环，第二轮温度梯度，跨度尽量大点，50到70度吧，做个5管就行了。

• jude (2015-8-05 09:49:06)

  
  我做5‘的时候也出现过你说的情况，不过现在我已经得到了我要的目的基因。我使用的是加接头的方法，我没有做巢式PCR，就是在合成引物的时候我本来合成的Tm值是72°，出来发现只有62°，当时我也没有管它，索性死马当活马医，我使用的反应程序是：Clontech公司提供的2号程序。不过那个扩增用的酶我使用的是Advantage酶，反应体系也是参考Clontech公司的说明书上做的，效果不错。很轻松就做出来了。
  之前我也使用过很多其他的酶，什么普通的Taq，LA Taq，Ex Taq，HS Taq都使用过，感觉效果不是很理想，还浪费了我很长时间。

• 月牙牙 (2015-8-05 09:49:47)

  
  我用巢式PCR老是糊成一片，第5和7泳道好像隐隐约约有条带，我要的估计就是400多，但是也不亮。我把电泳图发上来看看。
  各位有经验的指导下哟，愁死

  
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• hyuu (2015-8-05 09:50:41)

  前一段时间做5race，用的是advantage酶，第一轮pcr后有一条带，第二轮巢式有另一条带，与我的目的条带非常接近，于是立即把下面的程序一气呵成，酶切也是非常之正常，但是，测序后的结果让我立马跌入谷底，不是我要的结果，也就是说，我race了一个与我目的片段一样的非特异性片段，各位高手指点一下啊

• hyuu (2015-8-05 09:52:09)

  
  提的总RNA有降解，特异性引物是19bp，不知是不是这原因，郁闷死了

• dog002 (2015-8-05 09:52:51)

  
  软件合成的TM值都是偏高的，引物合成报告单上的还是比较准确的
  我就是按照这个退火温度做出5‘RACE的
  但是每个人的情况都不一样，别人的方法不一定适应你的

• 月牙牙 (2015-8-05 09:53:39)

  ，你做5'RACE 顺利吗？你的程序是怎样设的呢？用巢式扩两轮的吗？

• queen (2015-8-05 09:54:35)

  
  还算顺利吧
  我的两条基因都是在引物报告合成单TM值左右做出来的

• queen (2015-8-05 09:55:11)

  
  巣式做不做都可以，并不是必须的，这只是一步验证 有的基因表达的丰度低，或者是引物不合适，经常会发生非特异的扩增，这样最好做一下巣式 具体要看你研究的基因的情况了 有的人的非常好做，有的人可能怎么也做不出来的

• 49888 (2015-8-05 09:56:03)

  
  还想请教一下啊,大家都说5race的rna质量要求非常高，但是相关资料明明说的是，smart主要针对的是丰度低的基因啊，有点不明白

• eor (2015-8-05 09:56:22)

  
  对RNA的质量要求高是为了保证序列的完整性，可以获得最大限度的5'UTR

• 49888 (2015-8-05 09:56:49)

  还有一个问题想问问啊，我第一次p出一个小一点片段，第二次巢式p出一个更大的片段，比对后发觉第一次的片段只是第二次片段的一部分，今天问了一下takala的技术支持，她说巢式应该是片段更小才对，想了一下也是这个道理啊，那我这个片段是怎么回事呢，是哪里的问题呢，是不是我的引物的问题啊？我的引物只设了19bp，而且离5端有点远，还有一段基因想知道它的编码区和非编码区，用什么软件可以看出来啊？还请各位大侠指点。

• eor (2015-8-05 09:57:11)

  
  你说的比对是测序之后比对的吗 还是只是看电泳的结果
  从原理讲，巣式就是应该比较小。你的这种情况我没有遇到过，我也不清楚啊。
  我觉得你可以把你第一次PCR的产物切胶回收后再试一试，因为其实PCR产物的组成是很复杂的，以它为模板可能会有很多结果啊。
  可以用DNAstar或者是NCBI 上的ORF finder软件

• 49888 (2015-8-05 09:57:34)

  当时一看到600bp的片段，我已经高兴昏了，立即熬了一个通宵把下面的步骤一口气做了，所有的过程都很顺利，也很正常，然后测序后比对（用cluastalX软件），我的rna降解的比较厉害，但是我的那个基因丰度比较高，600bp的条带在电泳时比较弱，测含量都测不出来，然后连接是加大了量的，更令我郁闷的是比对时，与我的目的基因一样的地方很多，只是是断断续续的，没有成片的相同基因序列，相同序列之间老隔一两个基因，blast后吧，竟然与大肠杆菌100%同源，难道是污染了，400bp序列只是600bp序列中间一段，快疯掉了

• 49888 (2015-8-05 09:57:55)

  
  哦，对了，我的测序结果中只有我设计的特异性下游引物，没有找到巢式或者是其他引物哦

• eor (2015-8-05 09:58:33)

  我估计你可能是发生了单引物扩增
  可以做一个单引物的对照实验
  你的基因是一个多基因家族吗，这种情况很容易扩出你这种情况的
  如果RNA降解，建议从提 如果得不到完整的ORF是没有意义的

• 3.14 (2015-8-05 09:59:09)

  我在实验时，使用巢式PCR，觉得效果很好。
  但是我本人的经验表明，试剂盒带（CLONTECH）的nup通常不怎么有效，应该是在反转录时，所有的cDNA都被加上锚定序列的缘故吧。但也遇到过基因特异性引物怎么换都不行，结果用nup就扩出来的情况。
  我用普通的EXtaq 扩出三个基因的全长序列，酶应该不是主要的因素，毕竟反转录是最关键的步骤。
  如果能大概知道目的片段的长度，可以将第一轮产物相应大小的部分回收，稀释后作为下一轮的模板，应该也可以起到提高特异性的作用。
  有时后，经过三轮扩增才能得到目的片段，不要轻易放弃任何一对引物。

• 49888 (2015-8-05 09:59:37)

  单引物我是做了对照啊，我是把试剂盒中的引物序列送交公司合成，没有买盒子，现在等引物回来，重做，还有一个菜鸟问题啊：我做5‘race是不是从5’末端设计下游引物最好？之前的特异性引物比较靠近3末端，还有啊我的基因是有很多系列，我要的只是其中一个，引物设计，怎么弄blast上都有很多同源序列啊，还有一个问题啊，退火温度是不是直接用引物合成单上的要好一点啊，再次感谢各位啊

• 49888 (2015-8-05 10:00:06)

  还有个问题请教啊，引物设计都在序列的CDS区，怎么5‘race的引物要在非编码区呢？？？我把整个序列放上去，引物设计软件还是把引物设在CDS区啊，想不明白啊！！！Disapproved

• 079777chao (2015-8-05 10:00:31)

  哦
  我觉得你可能搞错了吧
  5'RACE的UPM或NUP是和反转录的时候加上的接头序列结合的，
  应该说5‘UTR越完整越好，这就要求你的RNA质量要相当的好
  至于你的特异引物设计在什么地方，这是和你已知的中间片段有关的，就现有的已知序列来说，无论是测序产生的EST或是同源克隆的中间片段，或者是用其它的方法获得的片段，绝大部分都应该是在CDS区的。假如你已知了非编码区，如果只是单纯的克隆基因，而不是要研究它的调控的话，就没必要做RACE了，因为在非编码区有很多的对信号做出反应的位点。
  只能肯定的说，GSP和NGSP肯定在你已知的序列上设计，和CDS没有必然的关系。