【求助】降落PCR与热启动

最新回复

• 3.14 (2016-3-01 11:45:37)

  我只能回答第一个问题——做热启动可以用普通Taq酶，也可以用更耐热的酶。我试过直接加酶，再变性，也能做出来。可能我的基因比较好拉吧。

• any333 (2016-3-01 11:52:29)

  
  1/ 热启动要用专门的热启动酶，即Taq HS.热启动酶是酶和抗体的混合物。在升温的过程中酶和抗体保持结合状态，直到变性温度抗体失活，酶才开始反应。因为防止了开始升温过程中酶就开始反应，热启动可以大大降低非特异性扩增。在预变性后再加酶也可以，但效果肯定没有用热启动酶好。很多公司的酶都有相应的热启动酶版本，价格大约是对应非热启动酶的一倍。用降落PCR最好与热启动联合。
  2/ 1微克这里指的是总RNA 还是mRNA都有可能。一般体系模版要求total RNA<=2ug，mRNA<=1ug。至于模版的下限取决于你的试剂盒的性能。你的RNA浓度为3.5微克/微升不用再稀释，在反转录过程中加水调到你要的模版浓度和总体积即可。如果你要用的方便，可以稀释成1微克/微升。
  3/ 好运气。

• 45778 (2016-3-01 11:52:47)

  楼上的不妥吧？
  没有听说过中途（预变性后）加酶也叫热启动？
  另外，降落PCR一定要用热启动，否则就失去降落的意义了 ！
  我是多专门的PCR技术指南是看的，自己也做过热启动，当然最好是用专用的热启动酶，省事！

• 气泡 (2016-3-01 14:34:04)

  
  谢谢三位!我做RT-PCR已经快三个月了,一直做不出来,想了很多原因.考虑过可能是RT时RNA加的太多,所以想稀释一下RNA再做,不知RNA多了是否会影响后续PCR?
  有人建议我做降落PCR,我用普通的酶做的,结果连杂带都没有,更不用说目的基因了.只有前面一团似乎是引物二聚体.真是郁闷呀!怎麽连非特异带都没有呢?

• 喵咪 (2016-3-01 14:35:06)

  
  试试跑个mg梯度

• 04906 (2016-3-01 14:41:29)

  
  我的情况和楼上完全一样，郁闷中，已经不知道该怎么变条件了，即盼回复，另外我还想问做一步法RT-PCR怎么做热启动？谢谢

• tuuu2 (2016-3-01 14:45:18)

  各位大侠:
  1:我最近正在做RT-PCR,可是一直没有结果,有人建议用降落PCR.,请教降落PCR必须与热启动联合才能做吗?如果必须用热启动那普通的Taq酶可以吗?有人说可以在预变性后再加酶,这样做可以吗?
  2另外,做RT是我用的是AMV请问RNA的量要加多少?说明书上说是1微克这里指的是总RNA 还是mRNA,我提组织后测RNA浓度为3.5微克/微升,做RT时要加多少RNA?RNA需要稀释吗?稀释成1微克/微升?然后取1微升?
  急盼回复!先谢了!
  1,降落PCR不必要非和热启动联合在一起.用普通TAQ酶当然可以热启动,和耐热酶没什么区别.
  2,我想应该是总RNA,一般情况下没有特别要求,RNA分析只需要提取总RNA,按你的浓度我认为加1-2ul,不需要稀释成1ug/ul

• 气泡 (2016-3-01 14:45:48)

  1我想问如果不稀释,加1-2ul,那不是有3.5-7ug吗?可amagic
  说一般体系模版要求total RNA<=2ug，mRNA<=1ug。这样会不会太多?
  2用普通酶如何做降落PCR?需要在预变性后加酶吗?
  谢谢!!!

• 气泡 (2016-3-01 14:46:34)

  普通酶加的时候在第一轮循环中向变性温度升温过程中达到65~70度时再加Taq酶,不过这种方法只适合对少数几个样本进行操作.另一种方法时用石蜡分层,将反应成分用石蜡分成上下两部分,当温度上升后将石蜡熔化,两部分成分混合,成为完整的反应体系.

• 45778 (2016-3-01 14:47:37)

  
  我用DNA做模板，也是跑了很长时间什么条带也没有，干干净净，好像能看到溴酚蓝前面的似乎引物条带。模板，引物，退火温度（包括touchdown）都做过了，热启动核心试剂盒。都降到退火35度了都不行，一个500bp，一个1000bp，真是想跳楼了。模板提取是用细胞裂解液，氯仿，异丙醇，乙醇，TE溶解保存。求好心的人帮帮我吧！

• kewanqi2011 (2016-3-01 14:47:57)

  楼上：问题可能出在模板和引物上
  建议用别的模板和引物做做试试

• ququer787 (2016-3-01 14:48:19)

  
  热启动PCR是针对非特异性产物设计的，可以提高产物的特异性。热启动PCR可分为物理方法，化学方法。物理方法就是将PCR各反应物加好之后，放在冰浴中（Taq酶活性降低），待PCR仪温度上升至70度，再将扩增管放入。化学方法有N-尿嘧啶糖基化酶法，Taq酶单抗法和酶修饰法。N-尿嘧啶糖基化酶法是在扩增管中同时加入微量的dUTP和N－尿嘧啶糖基化酶，在反应温度到达70度之前，dUTP可掺入非特异性结合的产物中，而正好可以被尿嘧啶糖基化酶消化，从而减少非特异性产物，温度到达70度后，尿嘧啶糖基化酶失活。Taq酶单抗法是设计针对Taq酶的单克隆抗体，在70度前，抗原抗体复合物使Taq酶无法发挥作用，70度以后抗体失活，Taq酶开始发挥作用。酶修饰法主要是在Taq酶的某些氨基酸残基引入温度特异性酶，经修饰过的酶在70度以下没有活性，70度以上开始恢复活性。降落PCR主要是在一系列逐渐降低的退火温度中进行PCR的过程，目的是寻求最佳的退火温度。降落PCR和热启动PCR配合，可以提高PCR的特异性，提高产量。但不是一定要联合的。

• PINK (2016-3-01 14:51:52)

  
  引物换过了不行，模板能跑出actin。也许该将退火温度上升试试，不用touchdown。比如62度或更高，60.5跑不出来。g+c含量高点，50，54，59％。tm：60，61， 63.5。我应该加添加剂么？比如DMSO？DMF？formamide？那种更适合？

• DDD (2016-3-01 14:52:42)

  
  我的情况完全一样，郁闷中，已经不知道该怎么变条件了，即盼回复，另外我还想问做一步法RT-PCR怎么做热启动？谢谢