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【求助】关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题
【求助】关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题
如题，碰到的个问题，我用制备型HPLC分别分离收集酸碱性异构体，按照主峰峰谷收集，之后进行浓缩，去分析型检测，所用柱子介质一致，只是体积不同。如图所示 结果虽然酸性异构体中酸性组分明显变多，但仍存在目的组分。目的组分纯度将近100，收集的碱性异构体更加神奇，酸性组分与碱性组分均增加。，目的组分的出现比较合理，收集碱性组分时，不应该还存在酸性组分。所以请教各位大神，是否有看到类似文献说 酸碱性异构体之间会相互转换 ？
我个人知识，也许会有转换，比如C端赖氨酸存在显碱性峰，过程中被切除变成酸性异构体？ 只是原先结果显示该蛋白赖氨酸已经大部分被切除
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【求助】关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题
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最新回复
555444 (2016-4-13 12:42:00)
不知你上样量是多大，还有你的分析方法好像不好吧，看过很多色谱图，很少看见像你这样的色谱图，均向右倾斜，并且，右面几乎不拖尾，一般的色谱图要是拖尾都是右变的；另外酸碱组分很难分开的，等电点一般就差0.1，不过如果你分离方法好的话，还是可以得到的，见过文献上的分析图谱，分离效果不错，后面2个碱性峰的保留时间能相差1min左右，人家用的是WCX。
04906 (2016-4-13 12:42:17)
楼主提出了一个很有意思的问题。综合楼主和楼上站友们的意见，我的看法如下：
色谱左拖尾很可能是由于样品浓缩后上样量太大引起的。
酸碱组分在第一步分离的效果确实不够好，但是无论如何差，都不能解释为何“碱性异构体更加神奇，酸性组分与碱性组分均增加”
上述貌似神奇的现象很可能确如楼主推测的：“酸碱性异构体之间会相互转换”。至少碱性成分可以转化为酸性成分。在楼主浓缩过程中，有些影响酸碱性异构体的成分（如铜离子）会大大增加，从而导致碱性成分转化为酸性成分。
支持文献：cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3242844/')
上述文献相关关键结果：“While the acidic charge variant profile remained unchanged for all copper concentrations, the relative abundance of certain basic peaks increased with increasing copper concentration over the range tested。”
单抗电荷异构体的形成原因有很多（Heterogeneity in mAbs is represented by charge variants, typically caused by deamidation, isomerization, succinimide formation, oxidation, sialylation, N-terminal pyroglutamic acid or C-terminal lysine (Lys) clipping）。所以有许多可能的因素会导致碱性成分转化为酸性成分。
XYZQ (2016-4-13 12:42:31)
00无名指00 (2016-4-13 12:42:45)
HPLC使者 (2016-4-13 12:43:01)
one (2016-4-13 12:43:15)
应该不转化，好像根本没分开
牢骚科科长 (2016-4-13 12:43:47)
楼主提出了一个很有意思的问题。综合楼主和楼上站友们的意见，我的看法如下：
色谱左拖尾很可能是由于样品浓缩后上样量太大引起的。
酸碱组分在第一步分离的效果确实不够好，但是无论如何差，都不能解释为何“碱性异构体更加神奇，酸性组分与碱性组分均增加”
上述貌似神奇的现象很可能确如楼主推测的：“酸碱性异构体之间会相互转换”。至少碱性成分可以转化为酸性成分。在楼主浓缩过程中，有些影响酸碱性异构体的成分（如铜离子）会大大增加，从而导致碱性成分转化为酸性成分。
支持文献：cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3242844/')
上述文献相关关键结果：“While the acidic charge variant profile remained unchanged for all copper concentrations, the relative abundance of certain basic peaks increased with increasing copper concentration over the range tested。”
单抗电荷异构体的形成原因有很多（Heterogeneity in mAbs is represented by charge variants, typically caused by deamidation, isomerization, succinimide formation, oxidation, sialylation, N-terminal pyroglutamic acid or C-terminal lysine (Lys) clipping）。所以有许多可能的因素会导致碱性成分转化为酸性成分。
tuomu45 (2016-4-13 12:44:13)
现在主流的测电荷异质性是通过离子柱来分析，但是它的分辨率达不到我们理想中的要求（峰之间完全分离），但是这是现状，所以技术还有待进一步发展。既然分辨率达不到完全分离，那么表明组分之间没有完全分离，完全有可能酸性峰有碱性峰，碱性峰中有酸性峰（如果做过纯化，可能理解会更深刻）。个人认为，这种情况很正常。另外酸性峰，主峰，碱性峰不是纯物质，它们是一堆混合物，他们之间含量的变化是很复杂的。一点个人浅见。
hulu呼噜 (2016-4-13 12:44:30)
这个问题略久了，首先感谢各位战友的积极回答。 对于这个课题，后续又做了一些研究。 本人经过脱K之后发现，碱性峰比例相应减少（仍存在），而酸性第一个峰的比例明显上升，表明此酸性峰中确由碱性峰的一个成分脱K而来，另外碱性峰中并非只是一个翻译后修饰导致，而是一个混合物。对于是什么导致的翻译后修饰，样品正在送检打质谱，待日后再讨论。
ylhuang0502 说得现象以及文献我之前也有阅读过，因为我这里是纯化，用的制剂纯品，并不涉及培养液中的铜。
为了得到足够纯的样品，将第一次纯化的再重复分离，样品纯度上升不少，，但依然存在上述的现象。 将碱性组分一直往后收集，收集完不浓缩，直接分析，仍能见到约有10%的主峰。这个现象也说明，酸碱性质相近，在这样的分离条件下，（HPLC,WCX-10柱子）不能完全分离。
综上，出现最开始的情况，两种因素都存在，分离效果不佳以及转化问题。
TAT (2016-4-13 12:44:57)
ylhuang0502 说得现象以及文献我之前也有阅读过，因为我这里是纯化，用的制剂纯品，并不涉及培养液中的铜。
为了得到足够纯的样品，将第一次纯化的再重复分离，样品纯度上升不少，，但依然存在上述的现象。 将碱性组分一直往后收集，收集完不浓缩，直接分析，仍能见到约有10%的主峰。这个现象也说明，酸碱性质相近，在这样的分离条件下，（HPLC,WCX-10柱子）不能完全分离。
综上，出现最开始的情况，两种因素都存在，分离效果不佳以及转化问题。
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又看到楼主的图谱了，仔细看了下，第1个碱性峰是单K，第2个碱性峰是双K，一般要求仿制药是第1个碱性峰的含量大于第2个碱性峰的，楼主的含量反过来了，我们现在也遇到这个问题了；另外，又遇到个大问题：放大到50L时，碱性成分增到了20%，以前做的小试研发工艺是除去酸性成分后碱性是符合要求的，现在碱性占的比例变大，就不好办了，酸性成分比碱性成分好处理，现在还得重新研究工艺除去碱性成分，希望上游放大到100L又出现了新的酸碱比例。
8princess8 (2016-4-13 12:45:38)
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国内单抗研究的通病，不必说细胞株，也不必说培养基，单是短短的培养工艺一带，就有无限的问题。
1221 (2016-4-13 12:45:55)
1个K，2个K的峰，应该是能轻松分开的，lz梯度可以再优化。
PGK，P Amidated的一样导致碱性峰。
wiwi (2016-4-13 12:46:27)
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图谱看的不是很清楚。第一个第二个碱性峰是不是含K的峰要看CPB酶切之后的结果的，有可能第一个峰是P-amidated的峰，第二个碱性峰才是1k，而2K则很小。所以也有可能第二个碱性峰高于第一个碱性峰。我们做的就有这样的
另外说到放大后的酸碱比例出现变化我们也经常碰到，酸性峰还可以通过后期纯化降低，碱性峰就有点困难，我们当时碰到的问题就是1K的峰太高，导致件碱性峰一直超标
BUK (2016-4-13 12:46:57)
1个K，2个K的峰，应该是能轻松分开的，lz梯度可以再优化。
PGK，P Amidated的一样导致碱性峰。
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弱弱的问下，PGK和P Amidated具体代表什么意思？
我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺，对吗？
BUK (2016-4-13 12:47:19)
弱弱的问下，PGK和P Amidated具体代表什么意思？ ?我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺，对吗？
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你是真可爱还是逗我们的玩的，看文献之前做蛋白要懂序列的，PGK是C末端的三个氨基酸缩写，另外一个东东是缺失GK，P氨基酸被amidated了。
BUK (2016-4-13 12:47:42)
QUOTE:
好吧，关于PGK我想多了简森si (2016-4-13 12:48:10)
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我赞同你的观点，发现做发酵的根本不懂发酵，出现问题后，发酵人员和所谓的海龟工作15年大领导提出的解决方法真是笑死人，完全不是在理论之上的，最后看不下去了，我们做纯化的才给他们提出解决方案，唉，悲哀啊
8princess8 (2016-4-13 12:48:40)
细胞培养工艺是个大学问，抗体纯化上很多问题不好解决，培养上小道道太多了。
101010 (2016-4-13 12:49:11)
这个话题有点意思啊，有持续的关注。charge variants的分离我觉得还是displacement chromatography效果最好。另外，这个图谱确实不正常，整体偏右。现在国内做抗体药的，都没有人是全部都懂的，做培养的也许只知道发酵，但是对蛋白质的性质完全不了解，做纯化的也未必深度了解蛋白质。药物分析这块呢多数是以前做小分子的，后来转做大分子，方法虽然大同小异，但是蛋白质的复杂性决定了分析的复杂。每个部分如果没有一个牛人支持，基本就搞不成。7楼这个确实很有意思，我以前确实碰到过这种蛋白，离子柱可以分得很好，但是后面每一个单独组分再分析又变了，不过这样的抗体确实没碰到过。按道理，抗体的charge variant虽然有多种成因，但是在下游纯化完成后最容易发生的也就是oxidation和deamidation了，有些可能还有Asp的isomerization啥的。如果真像7楼说的，倒是可以分析抗体里面是否含有这种金属离子导致构象出现了变化。
PINK (2016-4-13 12:49:35)
Rituximab
cuturl('http://d.dxy.cn/detail/8018838')
Remicade
cuturl('http://d.dxy.cn/detail/7455129')
96523827.png
【求助】关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题