中国医学科学院蛋白质组学大会报告集锦

2011.11.25

组蛋白翻译后修饰研究进展

　　中国科学院生物物理所的杨福全研究员在研讨会上做了题为《组蛋白翻译后修饰研究进展》的精彩报告。

中国科学院生物物理所杨福全研究员

　杨研究员从以下几个方面，就近年来组蛋白翻译后修饰的研究进展做了综述。
染色体和染色质

染色体和染色质

染色质

　　染色体有DNA和蛋白质组成，是指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质缩聚而成的。

　　染色质由核小体重复单元组成。每个核小体是由H₂A、H₂B、H₃、H₄四种组蛋白各两个分子的八聚体和绕1.8圈的147个碱基对构成。核心是H₂A、H₂B、H₃、H₄四种组蛋白以二聚体(共八聚体)，DNA缠绕在核小体的核心上，组蛋白_H1与核小体间的DNA结合。

　　组蛋白的翻译后修饰(PTMs)

　　组蛋白会发生各式各样的翻译后修饰(PTMs)，这些修饰主要发生在从核小体表面伸出来的组蛋白氨基末端以及组蛋白的核心区。已经知道的组蛋白翻译后修饰主要有乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、类泛素化、ADP糖基化、脱亚氨基化、脯氨酸异构化、丙酰化等。

　　目前和修饰相关的乙酰化和甲基化非常重要，他们背后起作用的酶都是结构生物学、药物开发等方向的热点。

　　组蛋白翻译后修饰和组蛋白变体的作用

　　组蛋白的成分除了H₂A、H₂B、H₃、H₄、H₁等常规组蛋白外，还包括其他的组蛋白变体。组蛋白翻译后修饰和组蛋白变体能够影响各种各样的生物过程，包括：转录、DNA损伤反应、细胞周期、病毒感染、干细胞多能性、生殖和发育等。

　　杨研究员还简单的介绍了组蛋白密码的重要性和现在面临的研究难点。同时杨教授提到，研究发现组蛋白翻译后修饰与许多癌症有着密切的联系，在将其作为生物标志物方面，还需要大量的临床样本来验证。

　　组蛋白PTMs和组蛋白变体的鉴别与分析

　　杨研究员重点介绍了应用生物质谱方法对组蛋白PTMs和组蛋白变体鉴别、分析。蛋白质组学的研究是非常复杂的，因此可能需要使用多种方法，从不同层次去鉴定组蛋白的翻译后修饰。

　　Bottom up 蛋白质组学

　　Bottom up方法是蛋白质组学中应用最为广泛的MS方法。先将组蛋白酶解，然后将得到得肽段上LC-MS/MS分析。由于组蛋白在N端富含K和R，如果采用常规方法trypsin酶解，切到得肽段可能很小，使用液相效果就会很差或检测不到。也可以用ArgC去酶解组蛋白，这样得到的肽段会大一些，但是ArgC不太常用且性能不太稳定。针对这种情况，有文献报道，将组蛋白修饰的一些自由氨基，通过醋酐、丙酐让它丙酰化或乙酰化，之后再使用trypsin就非常好用，目前这种方法相对比较成熟。

　　但缺点是，同样的组蛋白修饰，一个位点上具有多个修饰，再加上不同位点上有不同的修饰，组合非常的复杂。Bottom up方法只能看到某一个位点上有肯定的修饰总体上看不到有哪些翻译后修饰组合。

　　Middlle down 蛋白质组学

　　为了降低Bottom up的局限性，我们可以使用Middlle down方法。使用Glu-C 或 Asp-N酶解，得到大的组蛋白肽段，分别使用联机或脱机HPLC检测，最后使用ETD 或ECD解离、分析。Middlle down MS可以看到组蛋白翻译后修饰组合的情况。同时还可以用于分析H4、H3、H2A和H2B变体及其修饰。

　　Top down 蛋白质组学

　　当以上两个方法都不能解决时，可以考虑使用Top down 方法，它是唯一能够区分所有组蛋白异构体以及其翻译后修饰的方法。比如变体在各自某个氨基酸发生变异，Top down方法在分析变体方面更有优势。但灵敏度低一些。

　　由于组蛋白的特殊性，往往需要将上述三种方法结合起来使用。

　　我们不仅仅是要研究翻译后修饰的表达谱，定量也非常重要，目前已经研究出了许多基于质谱定量的方法如细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术(SILAC)、MRM绝对定量等。

Q Exactive —— 蛋白质组学研究的综合平台

　　赛默飞世尔科技质谱应用工程师李静女士作了题为《Q Exactive —— 蛋白质组学研究的综合平台》的报告，介绍了Thermo Fisher在美国质谱年会(ASMS)上新推出的高分辨质谱Q Exactive，及其在蛋白质组学方面的研究。

赛默飞世尔科技质谱应用工程师李静女士

　　Q Exactiv台式Orbitrap高分辨质谱具有高分辨率、高质量准确度、高灵敏度和宽动态范围等优势，使用该仪器和技术在诸多高端杂志上发表了30余篇文章，如《自然》16篇，《科学》3篇，《细胞》19篇等。Orbitrap质量分析器不需要液氦消耗，运行维护方便且成本低;不存在电子倍增器的消耗问题，不存在因电子倍增器的消耗引起的信号衰减问题，非破坏性检测器，可持续利用，可维护;高真空工作环境(10-10Torr)，超乎寻常的质量准确度和稳定性。

Q Exactiv 仪器平面图

　　Q Exactiv台式Orbitrap高分辨质谱是在高分辨率(14万)、高质量准确度的基础上同时保证高灵敏度、高采集速度的全新台式Orbitrap质谱仪。一个平台涵盖蛋白质组学的定性和定量要求，可在一次分析中完成包括发现、定性、相对定量和绝对定量的工作流程，其定量灵敏度相当于三重四极杆，具备宽定量线性动态范围，并且具备完整的定性和定量工作流程。Q Exactiv系统具有高分辨率、高扫描速度、高灵敏度、HCD碰撞模式、线性动态范围及高采集速度和通量等特点。对于复杂样品中肽段的定量，分辨率是关键，高分辨率可以更好的分辨目标肽段和内源性杂质，获得更加准确可靠的定量信息。对于外标法，20min连续正负离子检测模式切换后，质量准确度<1ppm(RMS)。SIM(selected ion monitoring，选择离子监测)定量模式，比Full Scan模式灵敏度提高5-10倍，尤其在复杂体系样品中。同时注入和检测，以及多重谱图，提高了采集速度和通量。

　　Q Exactiv集成了多项ZL技术，其新性能在蛋白质组学研究中优势明显，如下表。

Q Exactiv应用蛋白质组学的几点优势

　　下面，李工介绍了Q Exactiv系统在复杂样本中定量的一些实例，均获得了非常完美的结果，如单克隆抗体检测、阿普唑仑定量，生物标志物研究的不同阶段和相应策略等。最后，李工总结说，Q Exactiv系统具有多种检测模式;真正同时具备高分辨率、高质量准确度、高扫描速度、高灵敏度和宽定量线性动态范围;运行维护方便且成本低，非破坏性检测器，仪器性能稳定可靠;能完成对复杂体系样品中目标肽段深入信息的挖掘，在发现蛋白质组学和定量蛋白质组学同时发挥重要作用，一个平台涵盖蛋白质组学的定性和定量要求。

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糖肽富集分离新方法及糖链结构研究

　　中国医学科学院基础医学研究所李智立研究员作了题为《糖肽富集分离新方法及糖链结构研究》的报告，介绍了泛N-连接糖肽富集方法(GA-Zip Tip)，唾液酸化N-连接糖肽富集方法(TiO2-Zip Tip)，及N-连接糖肽结构分析等内容。

中国医学科学院基础医学研究所李智立研究员

　　糖蛋白质研究包括糖肽或蛋白分离富集和糖蛋白/糖链结构分析两部分。糖肽或蛋白分离富集技术主要有凝集素亲和色谱、肼解法、石墨碳固相萃取和亲水相互作用色谱(HILIC)等，糖蛋白/糖链结构分析一般采用质谱技术(MS)和核磁共振技术(NMR)。

　　李研究员对鸡卵清蛋白、牛胎球蛋白、人触珠蛋白和血浆样品，在GA-Zip Tip富集前后的质谱图进行了比较，并做了GA-Zip Tip富集肽段重复实验，同时研究了富集材料比例变化对OVA、Fetuin和Hp糖肽富集的影响，还得出了在GA-Zip Tip柱在线富集OVA糖肽(HPLC-ESI-MS)的结果，并对在线富集做了重复实验。唾液酸化N-连接糖肽富集方法(TiO2-Zip Tip)见下图，李研究员比较了高唾液酸化Fetuin糖肽、低唾液酸化Transferrin糖肽、无唾液酸化OVA糖肽和血浆中糖肽富集前后的结果，并对它们的连接位点进行了糖肽结构分析。