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溶血性链球菌的检验（二）
关键词：食品成分分析标准物质 环境化学分析标准物质 进口标准品 药品对照品溶血性链球菌的检验（二）
3．毒力试验
口型溶血性链球菌的毒力试验可用动物试验和链激酶试验。
①动物试验：取分离纯菌接种于葡萄糖肉汤中，于37℃培养24 h，取出0．2 mL接种于小白鼠腹腔内，如发病死亡即进行解剖取其心血接种于葡萄糖肉汤培养基内，37℃培养18～24小时后，观察有无试验菌生长。
②链激酶试验：致病性溶血链球菌能产生链激酶(溶纤维蛋白酶)，此酶可激活正常人畜血液中的血浆蛋白酶原，使血浆蛋白酶溶解纤维蛋白。
取草酸盐血浆0．2 mL(草酸钾0．01 g，加入血液5 mL，混匀，经离心沉淀，除去血球而得)，用生理食盐水稀释，再加入18～24 h的链球菌肉扬培养物0．5 mL，0．25％氯化钙溶液0．25 mL，摇匀，放在37℃水浴中，每隔数分钟观察一次，注意血浆是否凝固(通常约10 min即可凝固)。血浆凝固后，再注意观察及记录溶化的时间，一般说来，溶化的时间愈短，表示该菌产生的链激酶越多。溶化快的在20 min内可将凝固的血浆完全溶化，如果20 min后没有变化则在水浴中持续2 h再观察。2 h后将试管放于37℃保温箱内继续观察，以24 h记录作为最后结果。如凝块全部溶化为+，24 h不能溶化凝块者为－。
4．血清学鉴定
①分群鉴定：将分离出来的纯菌株，用热盐酸法提取链球菌的C多糖体作为群抗原，与群抗血清作沉淀反应试验，即为分群鉴定。
a．多糖体群抗原的制备：将分离出来的纯菌株，接种于5％兔或羊血清肉汤管(约5 mL)内，37℃培养6 h，再接种于100 mL0．2％的葡萄糖肉汤培养基，培养24 h后，离心沉淀，将沉淀物用生理盐水洗两次，然后悬浮于0．05mol·L-1盐酸溶液内，放沸水浴中15 min取出。离心沉淀，取其上清液，加入溴麝香草酚蓝指示剂1滴，并用0．2 mol·L-1氧氧化钠溶液中和，使溶液由黄变为浅绿色。若在中和时出现沉淀须离心除去沉淀物。该上清液即为C多糖体群抗原。
b．沉淀反应试验：该试验应在直径为2～4 mm小试管内进行。先将群抗血清注入小试管内，再沿管壁徐徐注入上述盐酸提取物，必要时可将该抗原(提取物)用生理食盐水稀释为1：10，l：20，l：40，1：80，1：160等，稀释后使用。两液重叠后，12～15 min观察结果，若为阳性结果，则在两液重叠面间出现明显的色环，无此色环者为阴性。
②分型鉴定：用上述分离出来的菌株纯培养物做抗原，与含有抗T物质的抗血清在玻片上进行凝集试验和分型鉴定。
a．T抗原制备：将在血清肉汤培养基中的培养转移到无盐肉汤培养基内，在22℃下培养48 h后离心沉淀，弃去上清液，即为菌体抗原。
b．凝集试验：抗血清按1：10，1：100，1：200，1：400，1：800等稀释，然后在洁净的载玻片上，与上述制备的菌体抗原进行凝集试验，同时以生理食盐水作对照，若在混菌的血清中发生凝集现象即为阳性，对照者应为阴性。
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