【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了？

最新回复

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:02:31)

  
  奇怪的是，当把这种PCR产物进行酶切，再电泳时，却没有出现这种现象，条带都很清晰而完整。见下图

  
  85139941.jpg

• 969 (2015-9-01 18:02:49)

  
  这种情况我在扩增actin的时候遇到过，当时我做半定量，但是内参和目的循环数不同，所以我在25个循环是拿出actin管子，跑胶就出现了和你类似的情况，我当时分析是因为没有进行后续的72度8min这一步，导致有些扩增产物没在尾端加上一些polyT，从而小了几十个bp，但是显然不适用你这种情况，有别的同志也遇到过这种奇怪的现象吗？都提出来探讨下，说说可能性吧。

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:03:05)

  
  嗯，我们没有省略延伸的步骤。
  但是分离的DNA似乎放的有点久了，会不会跟这个有关系呢？

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:03:28)

  
  我在小木虫发的帖子有站友说是胶做的有问题，上下浓度不一致，所以出现了两条带。如果是这样的话，为什么酶切产物看不出问题呢？两者用的是同一批凝胶。
  另外我个人猜想这种情况下（表层和底层之间出现了密度梯度）条带是不是应该拉的比较长，而不是分为两条？

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:03:46)

  
  我也觉得不应该是胶滴问题，DNA放久似乎也不可能。
  问下，你扩增的是cDNA产物吗？如果是，有可能你的cDNA体系里面混有痕量的基因组DNA，这样会导致扩增出两条带的情况。比如，这两者中间刚好就隔了个20-30bp的内含子么。

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:04:28)

  
  我们的模板不是cDNA.今天查了查，这种现象好像叫做“ghost band”，在western blot和微卫星序列的PCR中比较常见，不过机制可能与我们这个不同。我们的实验是做单核苷酸多态性SNP的。
  还有个师姐说可能是扩增产物自己形成了环。在网上说的，说的不是很清楚。有机会再问问她。

• 969 (2015-9-01 18:04:52)

  
  扩增产物自己形成了环
  这个有点意思哦，难不成是扩增产物自身形成了某种稳定的2级结构吗？产物还是一样的产物，但是由于有空间构象的不同，从而导致跑胶时出现这样几十个bp的微小差异，这样倒是有可能解释你说的这种现象哦！有达人能给出科学点的解释吗？

• dior (2015-9-01 18:05:07)

  
  这种现像很像是用不对称对引物扩增导致,跑得快一些的是单链,后面的是双链,当酶切时,双链切断,单链仍在

• baidukk (2015-9-01 18:05:25)

  这种情况我在扩增actin的时候遇到过，当时我做半定量，但是内参和目的循环数不同，所以我在25个循环是拿出actin管子，跑胶就出现了和你类似的情况，我当时分析是因为没有进行后续的72度8min这一步，导致有些扩增产物没在尾端加上一些polyT，从而小了几十个bp，但是显然不适用你这种情况，有别的同志也遇到过这种奇怪的现象吗？都提出来探讨下，说说可能性吧。
  
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  72度停留5－10分钟，竟然可以延伸出polyT，而且还有几十个之多，我以前没有见过相关的资料，不知如何得到的这样的结论的？
  一般的资料显示，停留这步主要还是保证产物的完整性，另外还会加A（TA克隆的依据）。环化的可能也不大，没有结构的基础！！楼上的解释可能更接近事实！
  另 楼主是否可以将详细的实验细节说明下，比如用的什么模板，引物，PCR的步骤等！

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:06:06)

  我们并非采用不对称PCR方法，而是经典方法，体系配制错误造成不对称PCR的可能性比较小(多次重复的结果)。之前未能提供实验细节，对不起各位。我将尽快发上具体实验条件（师姐的实验，我是助手）。
  不过即使是不对称PCR，酶切结果似乎也不改如图2那样。因为它基本符合我们的预期结果，没有多余的条带。
  另外还想请教，单链是否能被酶切？

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:07:05)

  
  相关疾病：
  先天性卵巢发育不全综合征
  实验目的：检测目的基因单核苷酸多态性S/X
  体系配制：10×PCR Buffer  2.50
  10mM dNTPs   0.40
  Taq DNA聚合酶（2U/ ） 0.40
  正向引物（25uM） 0.4
  反向引物（25u M） 0.4
  ddH2O   19.60
  模板（100ng/ ） 2.00
  总体积  25.00
  PCR条件
  94 C 变性 5min；
  94 C 60s，60 C 30s，72 C 45s 共35个循环；
  72 C 延伸 2min；
  预期PCR产物为488bp
  酶切反应
  经MnlI限制性内切酶消化后,SS基因型在胶图中有两个片断（285bp和203bp），SX基因型有三个片断（285bp、248bp和203bp），XX基因型有两个片断（248bp和203bp）
  电泳条件
  3%琼脂糖凝胶，110V，1小时20分钟，大的水平电泳槽，正负电极间距离有24cm

• chengjie79 (2015-9-01 18:07:22)

  
  我就是那位师姐。谢谢各位的热情帮助。希望这个问题能早日解决。
  另外，我发现国外发表的一篇论文（也是做这个基因的同一位点的多态性）的PCR产物电泳结果和我是一样的，也有条很靠近的条带，而酶切结果也是不出现此条带。

• feiya (2015-9-01 18:07:45)

  
  个人意见：
  战友可以考虑提供该国外论文的原文，给各位战友参考
  也可以考虑直接email 给该论文作者，询问论文作者对这个问题的解释。
  欢迎大家集思广益，继续讨论～

• 969 (2015-9-01 18:08:02)

  
  72度停留5－10分钟，竟然可以延伸出polyT，而且还有几十个之多，我以前没有见过相关的资料，不知如何得到的这样的结论的？
  一般的资料显示，停留这步主要还是保证产物的完整性，另外还会加A（TA克隆的依据）。
  yes，我搞错了，72度8min的目的是为了加上polyA吧，我随手写成了polyT，但是这个现象确实是我遇到过，而且不止一次，在PCR完成后不进行72度这一步，确实会出现2条带，大小相隔很近。

• shkudo (2015-9-01 18:09:03)

  
  不是polyA，一般只能加一个，加两个的概率要低好几个数量级！
  另外，同意版主的意见，把原文传上来，大家一起分析，毕竟很多人没有遇到过这样的情况！

• 969 (2015-9-01 18:09:30)

  
  长见识了，看来我对我实验出现双带的理解一直是错误的，72度处理8min原来一般只能加上1到2个碱基A，之前一直想当然了，呵呵！3q。

• am10 (2015-9-01 18:09:47)

  
  我做PCR实验时也会经常遇到这种情况，我认为这是引物的不特异，也就是说该引物可以扩增出除目的带以外的其他带，但是，你的酶切位点只存在于目的带上，所以酶切后是正常的。

• jude (2015-9-01 18:10:04)

  
  会不会是有多个拷贝？拷贝之间差异很小，酶切结果一致？

• 爱老虎游tt (2015-9-01 18:10:41)

  
  ……那么非特异性扩增产物哪去了？为什么酶切后的电泳见不到它们？

• toy (2015-9-01 18:11:00)

  这是国外论文的原文地址：cuturl('http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/95/12/2628')，在 Figure 1 上。
  我也会尽快和作者联系一下的。