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中国农大特聘教授发表CRISPR文章
2015年12月10日，中国农业大学特聘教授韩建永带领的研究小组，以Letter的形式在《Protein & Cell》杂志上发表题为“Highly efficient generation of biallelic reporter gene knock-in mice via CRISPR-mediated genome editing of ESCs”的学术研究成果。在这项研究中，研究人员提出了一种方法，通过用CRISPR技术对胚胎干细胞进行基因组编辑，高效地产生双等位基因报告基因敲入小鼠。
这项研究的通讯作者韩建永教授，为中国农业大学生物学院拔尖人才、特聘教授、博士生导师，从事干细胞与发育生物学及相关科研和教学工作。主持和参与国家“973”项目课题2项等，入选中组部“青年千人计划”、教育部“新世纪优秀人才计划”。曾以课题共同负责人（Co-PI）身份参与GIS资助项目1项。并以第一作者和并列第一作者分别在Nature、Genes & Development 和 Cell Stem Cell发表论文，申请美国ZL1项。
靶向基因敲除和基因敲入小鼠，是体内研究基因功能的重要工具。近年来，CRISPR系统的Cas9内切酶已被证明是基因打靶的一种强大工具。在单导向RNA（sgRNA）的指导下，Cas9蛋白可与特异性的基因组位点结合，产生靶向双链断裂（DSBs），以促进高效的基因组编辑。延伸阅读：用CRISPR给动物“改头换面”。
有研究曾经报道一种一步式的方法，通过向一个受精卵的细胞质中注入Cas9 mRNA与sgRNA以及单链DNA寡核苷酸复合物，在小鼠中产生了基因敲入。然而，产生携带报告基因的基因敲入小鼠，效率是很低的。利用Cas9蛋白结合双crRNA和tracrrna的mRNA，可大大提高效率，但在大多数小鼠中可导致单个等位基因修饰。
很少有研究报道，用CRISPR/Cas9系统转基因的胚胎干细胞（ESCs）制备报告基因敲入小鼠。在这项研究中，该研究小组报道了一种有效的方法，将CRISPR/Cas9系统与八细胞期胚胎注射技术相结合，可在一个月内快速生成双等位基因修饰的报告基因敲入小鼠。研究人员选择Tbx3作为候选基因，证明了该方法的可行性，因为他们之前已经报道，Tbx3可以提高诱导多能干细胞的质量。
这项研究结果表明，CRISPR/Cas9系统可以有效地在ESCs中执行一个报告基因盒的定点插入，然后通过向八细胞期胚胎注入双等位基因修改的胚胎干细胞，快速生成了双等位基因修饰的小鼠。使用这种方法，研究人员可以同时、快速地产生报告基因敲入的小鼠和ESCs，这使得研究人员能够同时在体内和体外研究早期胚胎发育的分子基础。
这种方法有几个优点。首先，荧光激活的细胞分选（FACS）可以很容易地用来识别正确靶定的细胞。在对绿色荧光蛋白阳性细胞进行分选时，研究人员选择了具有较高荧光强度的荧光蛋白。其次，ESCs是在两个小分子抑制剂（2 i）的存在下进行培养的。胚胎干细胞的质量，是八细胞期胚胎注射的重要决定因素。补充2i可以使mESCs保持在基态，与着床前小鼠外胚层相似。
然而，这种方法也有其局限性。这项研究所报道的方法可以有效地产生双基因修饰的报告基因敲入小鼠，但是，这种方法只适用于胚胎干细胞中的基因表达，因此，还需要进一步的改进。
