尊重你的细胞!科学家警告微小差异改变实验结果

2016-10-17 11:18 来源: 中国科学报/张章
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图片来源:Tek Image

  有的人博士学位泡汤了、拨款丢了,甚至几年的工作白干了,原因就是没有进行简单的质量控制。

  当Alastair Khodabukus试着在美国加州大学戴维斯分校的新实验室制作肌肉纤维时,他发现一些奇怪的事情:这些组织在痉挛。数年来,他一直在用同样的鼠源克隆技术培养纤维,但这些却与众不同。与之前他在英国邓迪的实验室培育出的纤维相比,它们需要更多的葡萄糖,而包含的能促进更快放松及不易疲劳的蛋白质则更少。Khodabukus认为,这些不同归因于美国牛的饲养方式不同。

  大多数大学实验室采用牛胎儿血清(FBS)培养细胞。牛的饮食、地理位置、年龄、是否使用激素或抗体,以及牛胎儿孕周等均会产生影响。FBS被作为培养基的补充物,它能影响人造组织的厚度,并能使产物模拟细胞活动,甚至影响表面接受器对给定化合物的响应。

  “FBS就像笼罩在头上的乌云,我们不知道它实际是什么或不是什么。”Khodabukus说。

  而血清只是研究人员在研究细胞时需要考虑的诸多因素之一。在去年召开的美国国立卫生研究院(NIH)细胞培养和再生研讨会上,生物制药公司“吉利德科学”的癌症生物学家Richard Neve就担忧,研究人员将变得不堪重负。“很多实验室面临大量问题。”

  一般而言,相关研究的最基本步骤是确保细胞的基因一致性。而且,细胞行为也会受到浓度、增殖率、培养基、污染物和培养时间等的影响。而血清是细胞培养基中最常见的补充物,并至少应保持一致。通常,人类血清包含数千不同的蛋白质和小分子。而FBS复杂性相似,且富含支持胎儿快速生长的物质。

  致力于研发血清替代物的Essential制药公司的首席科学官Adam Elhofy表示,在血清中,大部分细胞并不与血液直接接触,而是被液体包裹着。“血清里还富含荷尔蒙、生长因子和其他信号分子。”

  走向无血清

  为了克服障碍,试剂公司已经开发出无血清培养基。科学家也在追求“生物工艺”的应用,例如,药用蛋白质和疫苗的生产。而那些了解细胞对培养条件微小变化十分敏感的干细胞研究者也对此十分热衷。

  出于对一致性的担忧和推动转化医学的愿望,越来越多的研究者开始注意如何对待他们的细胞。MilliporeSigma 公司研究部战略营销主管Ken Yoon表示,这些都在鼓励科学家远离血清。

  但无血清培养基并非总是可行或实际的。“如果我们能不再用FBS,而是有一些更确定的东西,所有人都同意这是件大事。”美国国家综合医学科学研究所Jon Lorsch说,“问题是这有多切合实际?我们不知道答案。”

  大部分无血清剂型只针对特定细胞类型或相关细胞系群。例如,供应商为中国仓鼠卵巢细胞提供无血清培养基。但ScienCell实验室研发副总监Jennifer Welser-Alves指出,这些培养基并不适用于所有细胞类型:许多原始细胞被移出后,仍需要血清才能生长。“你能做的增加细胞并保持其增长的所有事情都是必要的。”她说。一些培养基要求增加至少2%的FBS,低剂量的血清有助于减少可变性。

  不过,芒特普林森的培养基顾问Paul Price指出,即便具有可行性,很多研究者也不希望花费时间或冒险掐断细胞的血清供应。“自1980年以来,人们一直说血清将成为历史,但到现在它仍然流行。”

  另外,Khodabukus提到,骨骼肌纤维尚没有商用培养制剂。他花费两年时间修改了配方,结合了数十种生长因子和其他信号分子。但纤维性能随不同血清出现变化,打乱了他的研究计划。“我计划用今后所有时间研究这一领域,如果能成功,则将能用于全世界每个实验室。”

  无法摆脱的血清

  Khodabukus 前博士后导师、加州大学戴维斯分校的Keith Baar则依靠一种更普通的解决方案:将实验室温度降低以储存血清。当血清快要用尽时,他会订购和检验至少4批货源,观察他们培养的细胞的效能,找出与当前实验最匹配的。

  之后,他购买了100瓶同样的血清。虽然这会花费其实验室2.5万美元,但也意味着他们能继续实验,不用花数月时间检验更多的血清。科罗拉多大学癌症生物学家Matthew Sikora指出,不检验其血清的研究者可能陷入麻烦。

  Sikora使用乳腺癌细胞系研究“弱雌激素”的效应。他购买了经过木炭处理的血清,以便剥离类胆固醇激素和其他多脂分子。然后他检验了血清中含有或缺乏雌激素受体的细胞,如果血清中的激素能被有效移除,那么这些细胞的增值效率应该一致。

  去年,他和同事不得不停止实验6个月,当时连续批次的血清均无法达到其实验目标。不同的荷尔蒙容量会“完全推翻”对一种癌症药物如何工作的解释。Sikora认为,血清中的未知变化能解释他与合作者不能得到一致结果的原因。

  即便研究人员进行批次检验,他们也可能不知道应当注意什么。但奥兰治儿童医院细胞和发育生物学家Mariella Simon表示,研究人员永远需要仔细。理论上,他们应该准备充足的血清完成整个实验。在使用一批新血清时,他们应该确保没有试剂发生变化,并与足够的旧血清进行比对,以避免因血清变化而出现的奇怪结果。

  另外,污染也会扰乱实验。最阴险的破坏者之一就是支原体。这种微小的细菌能偷偷溜过消毒器的边缘,并能抵御多种抗生素。它能吃掉细胞的营养并能改变DNA及蛋白质合成。

  传统的支原体检验需要数周,并仍会遗漏一些稀有菌株。美国模式培养物保藏所标准化工作负责人Yvonne Reid提到,基于聚合酶链反应(PCR)的检验能更快速准确地找到答案。

  为了避免血清被污染,一些研究人员还选择使用伽马射线。包括支原体在内的一些普通污染物均对射线十分敏感。但射线也会损害蛋白质和生物活性分子的生长。许多供应商也提供经过伽马射线照射的血清,国际血清产业联盟也成立了工作组检验这些血清的效果。

  错误无处不在

  细胞所处的物理环境具有深远影响。美国波士顿威斯研究所研究人员发现,培养基仅出现变形和流动就会改变细胞。不同品牌的实验室器皿能将不同的化学物质释放到培养基中,并扰乱细胞代谢研究。

  经过认真考虑的试剂添加也能以意想不到的方式改变细胞代谢:抗生素能损害线粒体活性。即便实验室冰箱的玻璃门也能摧毁研究,原因是培养基中的一些化学物质对光线十分敏感。此外,细胞在给定的培养皿中的生长也不相同。

  在这些实验中,细胞本身就变成最大的变数。英国伦敦大学学院癌症研究员John Masters指出,没有简单快速的方法能知道细胞是否符合要求。

  美国犹他州细胞培养顾问Leland Foster则认为,“实验室要远离这种变量则需要有专业人员指导。”他指出,培养细胞最好由细胞培养专家进行,而非实习生,前者能分辨出细胞在“微笑还是皱眉头”。

  在快速生长或相对稳定阶段的细胞,其反应并不相同。如果它们在培养基中的时间过长,还会发生其他变化,并影响增殖。即便能确证细胞的遗传统一性,细胞的其他重要属性也无法确证。Reid提到,由于存在如此多的不确定性,研究人员需要一周或更多时间优化细胞生长,并在实验开始前总结生长概况。生长概况能告知研究人员何时收获细胞、何时检测等。

  而重要的是,研究人员必须时刻保持警惕。“没有一套实验规程适合所有人。”Neve说。但忽视细胞的研究人员将会遇到更多困难。“有的人博士学位泡汤了、拨款丢了,甚至几年的工作白干了,原因就是没有进行简单的质量控制。”Masters说。