【求助】定量PCR数据处理

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-7-01 22:26 作者: duoduo 来源: 分析测试百科网

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用定量PCR进行基因差异表达研究，得到的数据多大才会认为有显著性差异？比如基因表达相差1.5倍，有没有实际意义?

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utt0989 (2015-7-01 22:27:07)

不是说相差多少倍就可以认为有差别，需要做统计学上的分析，看有没有差别。
nikonun (2015-7-01 22:27:31)

各个标本都是指数级，做哪种统计分析？
我觉得楼上说的是句空话！
greenbee (2015-7-01 22:27:50)

Sample number如果不多，用non-parametric统计方法吧。
另外要考虑表现有没有意义，应该再作蛋白质表现吧。
比如说western blot或是ELISA。
yayya (2015-7-01 22:28:06)

ABI定量PCR仪器在装机时是保证2倍拷贝差异的检测准确性在99%以上，换句话说，如果要从实时定量结果判断表达差异，应该是相差2.0以上是有意义的。但实际上，由于目前对差异计算中是否介入反应效率以及反应效率如何计算仍没有定论，因此很难说你所得到的表达量差异数值到底多少才有价值。
qumm1985 (2015-7-01 22:28:23)

本人做realtime多年，我觉得zhuchengliang 说的很对！用realtime PCR得出结果后要用t检验，即使增高10％，只要有统计学意义，就是阳性结果。另外，你还要看这种增高幅度是否具有实际医学或生物学意义。
zzzz (2015-7-01 22:28:41)

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病先天性卵巢发育不全综合征
各位好！
我最近用ABI的定量PCR仪进行基因的相对定量分析，但在结果的分析中总是有点云里雾里Embaressed。在这里向大家请教一下，如果问题问的太傻，大家不要笑我Embaressed。
这里用的是２＾（－△△CT）的方法。下面的是输出的结果（每４个孔是一组，第三组中有一个孔Omit；以第一组作参照进行比较）。
我不明白的是：△CT不都是用各组的均值计算出来的吗，怎么也存在标准误的问题呢？２＾（－△△CT）也是用均值算出来的，RQ的最大值和最小值又是如何计算出来的？
我想对下面的结果进行统计分析，是不是应该在SPSS中进行？
实在是不好意思，问题可能有点太傻，还请大家耐着性子给解答一下。非常非常非常感谢！
Ct  Ct std err  Avg Ct  Avg dCt  dCt std err  ddCt  RQ  RQ min  RQ max  Omit

29.701  0.211  29.966  14.82  0.275  0  1  0.627  1.595
29.691  0.211  29.966  14.82  0.275  0  1  0.627  1.595
30.583  0.211  29.966  14.82  0.275  0  1  0.627  1.595
29.889  0.211  29.966  14.82  0.275  0  1  0.627  1.595
30.46  0.028  30.417  13.825  0.116  -0.995  1.993  1.621  2.452
30.426  0.028  30.417  13.825  0.116  -0.995  1.993  1.621  2.452
30.95  0.028  30.417  13.825  0.116  -0.995  1.993  1.621  2.452
30.365  0.028  30.417  13.825  0.116  -0.995  1.993  1.621  2.452
31  0.197  30.746  14.597  0.207  -0.223  1.167  0.807  1.688
30.882  0.197  30.746  14.597  0.207  -0.223  1.167  0.807  1.688
               Omit
30.357  0.197  30.746  14.597  0.207  -0.223  1.167  0.807  1.688
zzzz (2015-7-01 22:29:00)

这个问题版内好像已经不是第一次出现了，但一直无人解惑，不知是为什么？
园丁## (2015-7-01 22:29:33)

相关疾病：
头痛
我也正在为此问题头疼，看看这个论文的例子可不可能启发我们。欢迎讨论
Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data
Using Real-Time Quantitative PCR and the 2–∆∆CT Method. Methods 25:402–408.
还有， dCT本身就是目的基因和内参基因CT均数的差值，难道标准误来自此处

87882696.snap.jpg
zzzz (2015-7-01 22:29:52)

图中c-myc和ＧＡＰＤＨ各自的均数及标准差的由来都好理解，但dCT的标准差却是从何迩来呢？
dCT的均数不就是目的基因和内参基因CT均数的差值吗？
zzzz (2015-7-01 22:30:55)

万分感谢timnan的详尽讲解！
不过我用上面的方法计算了一下qd_powerfu战友贴出来的那个例子中的数据，发现因为上面的计算方法中没有考虑内参基因的标准差，所以得到的△△CT的标准差与表中不甚相同，最后得到的kidney的△△CT的标准差是0.06（实际上与目标基因c-myc的标准差相同），这样的话最后作图得到的误差线应该与表中数据所得有差别吧？
不知是怎么回事？希望大家继续讨论！
pou (2015-7-01 22:31:11)

△△CT和△CT的标准差一样，都等于目的基因标准差的平方与内参基因标准差的平方之和的平方根。目的基因相对含量的最大最小值就是分别用△△CT的最大值和最小值计算出来的。（唉，打公式太麻烦，这么说又太绕了，不知我说清楚没有？！）。
zzzz (2015-7-01 22:31:30)

QUOTE:
原帖由 pou 于 2015-7-1 22:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

△△CT和△CT的标准差一样，都等于目的基因标准差的平方与内参基因标准差的平方之和的平方根。目的基因相对含量的最大最小值就是分别用△△CT的最大值和最小值计算出来的。（唉，打公式太麻烦，这么说又太绕了，不知我说清楚 ...
算了一下，确实是△△CT和△CT的标准差都等于目的基因标准差的平方与内参基因标准差的平方之和的平方根。可是为什么是这样算呢？cyc1sbs5战友能否给大家解释一下，多谢了！
zzzz (2015-7-01 22:31:57)

1、计算处理组和未处理组看家基因的平均Ct值
2、计算处理组和未处理组某一待测基因每一个测试孔的△CT，即处理组和未处理组待测基因Ct分别减去处理组和未处理组看家基因的平均Ct值
3、计算未处理组待测基因不同复孔△CT平均值
4、计算处理组某一待测基因每一个测试孔的△△CT，即用处理组某一待测基因△CT减去未处理组该待测基因不同复孔△CT平均值
5、计算处理组某一待测基因不同复孔的△△CT平均值
......

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我是按照上面的步骤算的：
１．得到的平均Ct值：brain 23.63; kidney 22.66
２-５　见下图

18438063.jpg
sunshine039 (2015-7-01 22:32:45)

呵呵，盼星星盼月亮一样，终于有战友出来讨论了！万分感谢timnan的详尽讲解！
不过我用上面的方法计算了一下qd_powerfu战友贴出来的那个例子中的数据，发现因为上面的计算方法中没有考虑内参基因的标准差，所以得到的△△CT的标准差与表中不甚相同，最后得到的kidney的△△CT的标准差是0.06（实际上与目标基因c-myc的标准差相同），这样的话最后作图得到的误差线应该与表中数据所得有差别吧？
不知是怎么回事？希望大家继续讨论！
......

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zzzz说的对，我这个统计方法的确有不当之处，为了防止前面的帖子误导他人只好删贴了。
sunshine039 (2015-7-01 22:33:09)

目的基因标准差的平方与内参基因标准差的平方之和的平方根。

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计算结果的确正确。看来有些统计学原理在里面了，难道又要饿补数学了？
用下面这种方法就好了。

80131940.snap.jpg
zzzz (2015-7-01 22:33:36)

用下面这种方法就好了。

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奥，原来就是直接用各孔CT值去减内参CT值，从而得到一组△CT，然后再求均数及标准差。
不过，这样求差值不是自己就配对了，不会影响统计结果吗？
memory (2015-7-01 22:34:05)

奥，原来就是直接用各孔CT值去减内参CT值，从而得到一组△CT，然后再求均数及标准差。
不过，这样求差值不是自己就配对了，不会影响统计结果吗？

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注释说：在一个体系里反应，同时测定目的基因和看家基因，探针分别用不同荧光标记。这个方法更好些吧，但是sybr不行了。
zzzz (2015-7-01 22:34:26)

对呀，这种计算方法恐怕只能用于在一个体系里反应，同时测定目的基因和看家基因。
那么sybr green的相对定量数据怎么统计呢？唉，真是挠头啊！
hulu呼噜 (2015-7-01 22:34:45)

很抱歉，我也忘了具体公式是怎么倒换过来的了，只记得以前学统计时就这么学的，而且ABI定量PCR的说明书上也是这么写的！
wmp1234 (2015-7-01 22:35:01)

忽然发现
我用的相对定量，delta TC method, Taqman probe,ABI 7300, software SDS 1.23
怎么没有标准误啊
只有标准差
请问你用的是standard curve based relative quantification? or delta CT?
如果是delta CT，根本就没有具体数据结果，软件直接就给算出了啊
糊涂了