一种新颖的糖基转移酶活性分析
糖基转移酶是催化单糖基团从糖基供体向受体底物转移的酶。其中大部分被归为Leloir酶，它们利用核苷酸糖作为供体，并在反应中生成核苷酸磷酸盐。分析糖基转移酶活性相当具有挑战性。最常用的方法是检测放射性标记的糖从供体转移到受体分子。各种非放射性的检测方法也被不断开发;然而，它们中的大部分是为特定糖基转移酶定制的。
R&D Systems现已开发出一种多功能的非放射性检测方法，能测定糖基转移酶活性(图1)。分析使用了一种特定的磷酸酶，它释放糖基转移酶反应过程中产生的核苷酸上的磷酸。随后利用孔雀石绿磷酸盐检测试剂来评估磷酸盐水平。因为释放的磷酸盐浓度与转移的糖分子量成正比，所以可测定糖基转移酶的动力学参数。此外，这种显色分析在96孔板中开展，适合高通量研究。
为了证明这种技术的实用性，我们评估了Clostridium difficile毒素B(TcdB;图2A)、人O-糖基转移酶I(KTELC1;图2B)和人ST6GAL1(图2C)的酶活。TcdB和 KTELC1是具有UDP-葡萄糖水解酶活性的糖基转移酶，它们在反应中生成副产物UDP。磷酸酶CD39L3水解核苷酸β-磷酸盐，并从UDP上释放出游离的磷酸盐。相比之下，ST6GAL1是唾液酸转移酶，它催化了N聚糖中唾液酸从α2,6转移到β 1-4GlcNAc结构。对于此反应，CMP-NeuAc充当供体底物，而N-乙酰乳糖胺(LN)则充当受体。利用5’核苷酸酶CD73从反应中产生的 CMP上释放出游离的磷酸盐。
对于这三种糖基转移酶的反应，利用孔雀石绿检测试剂测定游离磷酸盐水平，以获得相对供体底物浓度的特定活性(pmol/min/µg)的准确测定(图2)。
R&D Systems已使用这种技术测定了多种糖基转移酶的活性。
