【求助】关于RNA琼脂糖电泳的方法和详细步骤

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• yyaxw84 (2015-7-01 21:34:41)

  
  琼脂糖凝胶电泳
  　　琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。
  　　【材料】
  　　1．琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40m MTris ,20 mM NaAc,1mM EDTA PH8.0）
  　　2．载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml ）
  　　3．凝胶槽、电泳仪
  　　【方法】
  　　1．取琼脂糖0.9g，加入100ml 1x TAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，1000C加热溶解。
  　　2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。
  　　3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml 的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至500C左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。
  　　4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。
  　　5．DNA 样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。
  　　6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。
  　　7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5s RNA和0.3 kb DNA
  8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。
  rna与此大同,只是其更易降解,操作要小心.

• bangqi_k (2015-7-01 21:35:09)

  
  实验书上说是要用甲醛变性的。可是一般就是用非变性的，比较方便，不过之前电泳槽要用3％的双氧水处理一下，然后用无水乙醇洗一下，后面 就和一般的电泳没有什么分别了

• bgf5 (2015-7-01 21:35:52)

  
  相关疾病：
  头痛
  对呀,就是看到书上说是用甲醛变性,觉得麻烦,缓冲液的配制就够头疼的了,那如上面的师兄所言,用非变性的方法,就是可以和DNA电泳用一样的电泳缓冲液和载样缓冲液吗?谢谢了

• bangqi_k (2015-7-01 21:36:24)

  是的，我们跑rna时也没进行甲醛变性，就是用DNA电泳的电泳缓冲液和载样缓冲液，而且也没有用3％的双氧水等处理，也能跑出来，不过小心一点还是好的。

• bgf5 (2015-7-01 21:36:45)

  
  谢谢了，那我就注意把条件处理好些。

• wawa (2015-7-01 21:37:03)

  
  看了以上几位的介绍，有些疑问，我也跑过RNA电泳，按照平常DNA电泳的条件跑过但是就是跑不出来，RNA溶液我是加样了3ul，是不是我提取的RNA量不高呢？

• bangqi_k (2015-7-01 21:38:10)

  
  有可能的，你可以把电泳槽洗一洗，加大rna上样量，如果还不行，就可能是rna提取的不太好，只有重新提了。

• qumm1985 (2015-7-01 21:38:39)

  请教各位高手几个问题：
  1.因为实验室条件不好，电泳槽只有一个，是公用的，而且电泳缓冲液和琼脂糖等都是公用的。别人一般用来做pcr产物的电泳鉴定。我想做rna的琼脂糖凝胶电泳，我用DEPC处理过的水来配置TBE液，电泳槽也用双氧水处理，应该对他们的电泳没什么影响是吧？
  2.但是他们用来跑PCR产物，对我的电泳会不会有影响？也就是说他们加的样品会不会弥散到电泳缓冲液里面去，对我的样品有污染。
  3.有人要做质粒的大提鉴定，中间要用到RNA酶，他提取出来的质粒DNA中会不会残留RNA酶？
  4.跑电泳的时候不加MARKER行不行？因为实验室里没人做，买RNA MARKER太贵了，只想看看是不是能跑出比较和条件的条带来。
  5.上样缓冲液必须得加吗？只用溴酚兰不行吗？
  多谢各位！

• mickeylin (2015-7-01 21:38:56)

  
  先回答第一个问题：你的DEPC水高压消毒了吗，如去毒了那就对别人应该没有什么影响。
  第二个问题：有可能对你的实验结果有一定的影响，因为他们跑PCR产物，那些产物不可能没有全部都在琼脂糖上，总有一些会弥散到缓冲液里，而且缓冲液不是经常更换的，反复的PCR产物电泳必然会造成RNA酶的污染，你也不是每次跑电泳就更换缓冲液和清洗电泳槽的，是吧。
  第三个问题：其实回答你第二个问题就提到了这个问题，就不谈了。
  第四个问题：MAKER相当于一个标尺，是参照，没有它，你跑出来的条带再漂亮，你也说明不了什么问题，那你说拿什么来比较呢。
  第五个问题：上样缓冲液当然要加，也不麻烦，你不会告诉我配40％的蔗糖溶液都嫌麻烦吧。

• changlhsyo (2015-7-01 21:39:14)

  
  相关疾病：
  1、如果只是一般检测，RNA电泳可以不用甲醛变性胶，太麻烦。电泳槽最好事先用3%双氧水泡半小时；
  2、如果和DNA的公用一个电泳槽，那就最好每次把槽里的缓冲液倒掉换你的再跑RNA；
  3、电泳时间尽可能短，溴芬兰跑出1~2厘米就足够了；
  4、RNA一般只有rRNA是有较复杂二级结构使得EB可以嵌和进去的，mRNA和tRNA EB是染不出来的，所以一般不论你材料是什么，总RNA的电泳图谱就是三条rRNA条带（5s有时看不清，28s亮度是18s的2倍），跑不跑MARKER对你根本没有什么用处；
  5、上样缓冲液的目的主要是增加样品密度，使样品沉下去，当然不加理论上也是可以的，前提是你的上样手法足够高超；

• xyw5 (2015-7-01 21:39:35)

  上面两位高手的意见好像相左啊，弄得我好糊涂啊！Sad有没有人给我指引一下？万分感谢！

• vcve (2015-7-01 21:40:01)

  
  其实没有什么特别的，只要用DEPC配液，电泳保持低温（冰浴），低电压慢慢跑就好

• vcve (2015-7-01 21:40:33)

  上面两位高手的意见好像相左啊，弄得我好糊涂啊！Sad有没有人给我指引一下？万分感谢！
  
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  呵呵，要辨证的看问题嘛，我们俩说的都没有错，关键看你具体的实验目的了。
  如果你的实验中RNA是非常重要的实验结果甚至是最终结果（如siRNA），那你自然要跑出一张非常漂亮的RNA电泳图，那就最好严把每一环节，设立一套RNA专用的仪器试剂，并在电泳时加MARKER。但如果RNA只是你实验中的一小步（比如大批量RT-PCR中的某一次），你跑电泳只是想看看今天提的RNA的质量如何，那就完全可以粗放一些了，用DNA的槽也是可以跑出三条带的。而且此时加MARKER你不觉得奢侈吗？等熟练了以后，可能你连电泳都懒得跑就直接RT了呢。
  还有楼上所言也是很有道理的，电压不能太高，否则发热对RNA是不太好的。

• xyw5 (2015-7-01 21:40:58)

  
  最近科里有事，好久没上来了。非常感谢“雕弓满月射天狼”。
  我做RNA电泳只是想看看提的RNA质量如何，虽然得到的沉淀量很大，但是有人说是蛋白质污染，而且因为标本已经好长时间了，没有好好保存，很怕已经降解了，所以想跑一下电泳看看。
  另外还有个问题请教您一下，电泳缓冲液用TAE还是TBE好呢？我看到PCR电泳时也是不一样的，有人用TAE有人用TBE,能否告诉我这两种缓冲液使用起来的区别？多谢！

• standbyme (2015-7-01 21:41:14)

  蛋白污染是不是很严重只要测下OD260/OD280就可以了，二者比值在1.8～2.0表示RNA纯度很好。如果很低那就表明蛋白污染严重了。
  至于TAE与TBE，二者的区别主要在于：
  1、TAE的缓冲容量比较低，长时间电泳会使其缓冲容量几乎丧失，所以需要经常更换。而TBE的缓冲容量较高；
  2、双链线状DNA在TAE中的迁移速率比在TBE中快将近10％；
  3、电泳时这两种缓冲液的分辨能力没什么太大区别，只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率比在TBE中更好一些；
  4、二者成分的主要不同在于TAE中是醋酸而TBE中是硼酸，所以后者比前者的成本要贵一些；
  5、TAE的贮存液是50 X的，稀释成1 X使用，而TBE是配成5 X，稀释成1 X或0.5 X使用，所以如果你配置同样体积的TAE和TBE贮存液，那么前者使用的时间将是后者的5～10倍，会省事一些；
  综上所述，一般琼脂糖电泳时还是用TAE比较方便一些。而聚丙烯酰胺电泳的话还是用TBE较好，这是由于聚丙烯酰胺电泳动辄要跑3～5h，甚至过夜都有可能，TAE的缓冲容量往往不能胜任。

• vcve (2015-7-01 21:41:44)

  非常感谢你的帮助！
  我还有个问题要请教（我的问题好像太多了点Blush）：如果提取的rna真的有蛋白质污染，怎么办？还有补救的办法吗？

• duoduo (2015-7-01 21:45:27)

  用等体积氯仿抽提一遍之后再用等体积异丙醇沉淀下来重新溶解就可以了。
  如果你现在RNA的体积较小，那么最好先补水至100ul吧，要不然氯仿抽提后上清太少不好吸。
  用异丙醇再次沉淀时别忘了加1/10体积醋酸钠（4M），否则沉淀不下来的。
  不过轻微蛋白污染一般不会对后续实验带来太大麻烦的，反倒是这样处理一下损失不小。