查看完整版本请点击这里：
【求助】DNA甲基化(CpGenome™ DNA Modification...
目的：1.DNA甲基化处理，2.甲基化特异PCR【求助】DNA甲基化(CpGenome™ DNA Modification...
已试方法：
利用chemicon 公司的CpGenome™ DNA Modification Kit 进行甲基化处理（步骤见下）；
参考文章订购了FAM标记引物进行PCR.
结果：DNA甲基化处理后紫外分光光度计测试230nm吸收特高（盐及小分子物质？），260nm约0.14左右，做了好几次，最后有几个浓度月200多ng/ul，但是230nm吸收还是很高，260/280高达7。虽然如此，电泳最终还是有条带了，但是用这个DNA去MSP，总是出现和阴性对照一样的dimer（primer浓度调试过）
排除的情况：原DNA是好的（电泳测试过）；引物设计（引用多篇权威文章的）；PCR仪器没问题；操作没问题。
可能的情况：在甲基化处理时需要用以下自己配的
Reagents
a. NaOH pellets
b. 70%, 90% and 100% EtOH
c. β-mercaptoethanol
d. TE Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)
我用的 NaOH pellets只有96%纯度的，是不是这个罪魁祸首？
提问：在加入DNA时，原则要求1微克，我多加了一些（为了多点产量），行不？
请用过这个kit的朋友多多帮助 ，积分感谢，尤其是做过人雄激素受体的MSP的（HUMARA基因）。非常 急 。xx(xx(:X:X
查看完整版本请点击这里：
【求助】DNA甲基化(CpGenome™ DNA Modification...
【求助】DNA甲基化(CpGenome™ DNA Modification...
最新回复
阿福 (2016-4-08 15:54:17)
2.2 DNA修饰
2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水100µL，再加1.0µg DNA,最后加7µL 3M NaOH，混匀。
如样品中DNA不足1.0µg时，加 DNA 修饰试剂IV，补水使总体积达到100µL，然后加7µL 3M NaOH，混匀。
（98µL水 + 2µL DNA 修饰试剂 IV + DNA样品 + 7µL 3M NaOH）
2.2.2 50℃ 10min
2.2.3 加550µL新鲜配制的DNA 修饰试剂 I，漩涡混匀。
2.2.4 50℃ 16h。
2.3 完成化学修饰，DNA洗涤
2.3.1 重悬试剂Ⅲ，漩涡混匀，确保混匀。
2.3.2 取重悬好的试剂Ⅲ5µL至上述DNA溶液中，再加入750µL试剂Ⅱ，轻轻混匀。
2.3.3 室温孵育5-10min，5000g 离心10sec，弃上清。
2.3.4 加1ml70%乙醇，漩涡混匀，5000g 离心10sec，重复三次。
2.3.5 第三次去除上清后，再高速离心2min，吸去残存的上清。
2.3.6 加50µL 20mM NaOH/90% 依存与上述样品中，漩涡混匀，重悬沉淀物，室温孵育5min。
2.3.7 5000g 离心10sec，直接加1ml90%乙醇，漩涡混匀，洗涤沉淀，离心弃上清，重复两次。
2.3.8 第二次上清去除后，再高速离心3min, 吸去残存的上清,室温干燥10-20min.
2.3.9 加TE Buffer（10mmTris/0.1mmEDTA,pH7.5）漩涡混匀。Buffer的量取决于开始时DNA的量。（一般25-50µL）
2.3.10 50-60℃ 15min。高速离心2-3min，转移上清至另一Ep管中。
2.3.11 进行MSP或sequenceing,或储存-15℃~-25℃，可保存两个月；-80℃六个月。可分装，避免反复冻融。
2.3.12 当保存的样品融化后作MSP时，避免将析出的试剂Ⅲ加入，可先离心去除沉淀。
131415 (2016-4-08 15:54:33)
2.3.7 5000g 离心10sec，吸取上清至另一Ep管中，加1ml90%乙醇，漩涡混匀，洗涤沉淀，离心弃上清，重复两次。
Onobel ,你好，我也正在做MSP，用的也是这个试剂盒，现在的PCR也还没有做出来。我要告诉你的就是，2.3.7的这一步你是做错了的，你可能是按照DXY中别人的贴子做的，当时我看到这句话翻译的与试剂盒上的操作好象有出入，我特地联系了翻译这个的战友，他现在也在做MSP，他已经有过成功的经验了，他已经明确告诉我，在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇。
另外，我在核酸技术版发了个帖子的，有几个做了这方面的高手提出了许多宝贵的建议，你可以去看一下的。
PINK (2016-4-08 15:54:48)
2.3.7 5000g 离心10sec，吸取上清至另一Ep管中，加1ml90%乙醇，漩涡混匀，洗涤沉淀，离心弃上清，重复两次 。
加50µL 20mM NaOH/90% 乙醇与上述样品中，轻弹混匀，不别离心，直接加入1ml90%乙醇，混匀。
根据本人经验，上述protocol略作一下修改：
1.在试剂1配置中，原说明书中大约用20µL 3M NaOH调pH，应调整为40µL，否则达不到所要求的pH。
2.在用乙醇洗涤离心时， 5000g 离心 1 min，否则吸上清时会带走试剂3，导致DNA丢失。
3.在每一步洗涤后重新加入乙醇洗涤时，用手指将沉淀弹起，不必漩涡混匀，剧烈涡旋会将DNA断裂。
4.在加入DNA时，原则要求1微克，我多加了一些（为了多点产量） ，影响不大，我的可能都大于1微克（5µL）。
www.1 (2016-4-08 15:55:06)
1.在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇:是这样的，我在上贴中已修改。
2.是的。每步都一分钟，转速可以提高。
3.混匀时只要弹起就行了，不必彻底混匀。我的离心机不能定10sec，只能点动离心，所以容易弹起，而且也容易吸走，
个人经验，仅供参考。
祝顺利！
阿福 (2016-4-08 15:56:00)
1.战友提到“在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇”，而zrzhong6519 君说“吸取上清至另一Ep管中，加1ml90%乙醇到这个Ep管，漩涡混匀”， 似乎有点出入。
2.战友君说的“乙醇洗涤离心时， 5000g 离心 1 min（原来是10sec）”，是包括70%乙醇和90%乙醇洗涤吗？都是1分钟？
3.说的“在每一步洗涤后重新加入乙醇洗涤时，用手指将沉淀弹起，不必漩涡混匀，剧烈涡旋会将DNA断裂”，感觉10sec的离心后沉淀都比较难弹起啊，呵呵（这是我过分了）
再次谢谢pzhl2004 和zrzhong6519 君，俺马上开始修正，如实验顺利，5分赠送（实在没什么好表示的）
PINK (2016-4-08 15:56:20)
1.在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇:是这样的，我在上贴中已修改。
2.是的。每步都一分钟，转速可以提高。
3.混匀时只要弹起就行了，不必彻底混匀。我的离心机不能定10sec，只能点动离心，所以容易弹起，而且也容易吸走，
个人经验，仅供参考。
祝顺利！
阿福 (2016-4-08 15:56:38)
我在修正实验后，甲基化的DNA在230nm处吸收还是过高，电泳无带，晚上测试PCR看看有没有结果。
阿福 (2016-4-08 15:57:46)
PCR后还是没有条带出现..................555！！
菜鸟丙 (2016-4-08 15:58:06)
你可以提高模板量试一试，另外再多试几个温度，延长变性、反应及退火时间，我都使用1min，40 cycles。
wanglaoshi (2016-4-08 15:58:24)
QUOTE:
我的预计产物只有200bp。看了这里很多的MSP帖子，似乎大家都很困难。
HPLC使者 (2016-4-08 15:58:41)
阿福 (2016-4-08 15:59:04)
QUOTE:
不好意思，我不懂什么是玻璃奶珠？不过修饰过程中始终没有看到黑色的东西。HPLC使者 (2016-4-08 15:59:30)
是的，MSP确实不好做，就是现在也不是每次都能成功。你的产物200bp应该好一点，我的产物只有100bp。
上海肿瘤所作的比较多，而且做得基因也比较多，他们好像都使用手工修饰的。
阿福 (2016-4-08 15:59:46)
HPLC使者 (2016-4-08 16:00:04)
阿福 (2016-4-08 16:00:22)
你认为230nm处吸收过高（盐和小分子物质）的可能性出错的地方是...？:I:I:I:I
阿福 (2016-4-08 16:00:44)
应该是改成：
2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水90µL，再加1.0µg DNA（100ng/µl）,最后加7µL 3M NaOH，混匀
是吗？
碎星星 (2016-4-08 16:01:25)
问:2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水90µL，再加1.0µg DNA（100ng/µl）,最后加7µL 3M NaOH，混匀
是吗？
答:这个是要求加了水后总体积达到100ul的,加多少水就要看你是加多少ul的DNA了.
HPLC使者 (2016-4-08 16:01:54)
toy (2016-4-08 16:02:09)
我没有做过甲基化方面的东西，但今年暑假时听过这方面的讲座，是我们医院出去的一个牛人，去美国五年了，一直做甲基化方面的东西，做了很多工作，在SCI上发表文章11篇，我把他的E-mail pm给你，跟他讨论应该能解决部分问题。并请为我保密他的邮箱！！！
【求助】DNA甲基化(CpGenome™ DNA Modification...