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质谱沙龙第二十一期活动报道

2009.7.27

【导语】在药物分析的技术讨论之外，拓展了质谱沙龙的涉及范围：增加了质谱相关新技术MassWorks的讨论；GC/MS在公安法医中的应用；以及蛋白质组学同位素标记、磷酸化翻译后修饰鉴定的最新研究进展。

　　2009年7月25日下午，质谱沙龙第二十一期活动在第二炮兵总医院胃食管返流中心示教室举行。除了来自发酵研究院、二炮总医院、清华大学、AB公司的老朋友外，还有来自中科院研究生院、中科院高能物理研究所、公安部物证鉴定中心、和北京绿绵科技公司的新朋友。

第二十一期质谱沙龙活动现场

　　第二炮兵总医院质谱检测中心简介及定量应用

第二炮兵总医院药剂科李鹏飞老师

　　首先由来自第二炮兵总医院药剂科的李鹏飞老师向大家介绍了二炮总医院药学部质检中心科研方向与发展工作简介。

　　二炮总医院质谱检测平台主要工作方向包括中毒药物快速筛查、体内药物分析测试及I期新药试验测试。该平台于2006年3月安装3200 Qtrap型液相色谱质谱仪，还配备氮吹仪、固相萃取仪、高精度天平、高速离心机等。

　　该质谱检测平台的研究方向首先是为临床服务，例如利用质谱技术进行血药浓度监测、建立定量检测人体内44种氨基酸的准确方法、中毒药物多目标快速筛查与定量等等;第二方面是科研创新，与北师大一起进行一些课题研究如参与863课题——结直肠癌脂类组学肿瘤早期诊断新技术的研发、973课题海河项目——环境中8种雌激素的检测工作;第三方面则是成果转化，注重研究成果的应用性。

　　接下来李鹏飞老师重点讲述了质谱技术在医院药学方面的定量应用要点。

　　灵敏度问题：

要用目标离子的碎片定量，特征性强，排除干扰。可考虑分子离子峰、准分子离子峰或特征碎片。
在定量分析的方法设置上，尽可能提高扫描速率。提高准确率和重复性，可以通过减小扫描质量数的范围来提高目标峰的扫描次数，或将一个样品全部分析时间段分成多个segments，对目标离子单独设置扫描模式。
一定要通过色谱柱分离后定量分析。避免竞争性离子的存在影响目标离子的离子化效率;如果目标分子未与竞争性分子完全分开，则在离子化过程中导致目标分子的离子化效率降低，导致样品分子的定量结果偏低，当然标准浓度的样品也要用相同的方法分析。
如果样品都是纯品的话可以不经过色谱柱直接进样分析。

　　关于重现性的经验和小技巧：

如果用的离子源的喷针位置是可移的话，一定要记住做标准曲线时的位置，否则其位置移动后在相同的条件下进入质谱的离子流量会发生改变，标准曲线就不能使用了。
所建立的标准曲线一个月后如果想重复使用，则用QC样品检验一下该标准曲线!
对于已经建立好的分析方法在扫描范围、流动相的组成、梯度或流速等方面不要作任何改动，否则，标准曲线要重作。
对于热稳定性不好的样品可以通过提高气速，降低毛细管温度的方法保证定量分析的重复性；一旦方法固定后不要轻易改动。

　　多组分同时定量的方法中出现的一些问题和对策

1、各组分定量限相差极大，检测限上的限制。如：A浓度远大于B药(100~1000倍)。此时B药检出时，A药高于质谱检测上线;若A药检出时，B药未检出。

　　处理方法是：修改灵敏度高药物的参数，使其响应值降低未到达质谱检测上限。但该方法有一定的局限性，如果设置参数过低的话将会导致曲线不理想。在多离子通道时也可选用非最优离子对的方法或采用正负离子切换来解决灵敏度问题。

2、曲线上的同步问题，A药和B药混合曲线不成线性。

　　国家药代指导原则指出在该化合物线性研究不理想的情况下，可采用非线性曲线，但工作曲线上的点一定要充足。

　　3、单组分质控不各格，而其余组分合格问题。

　　指导原则是对于不同浓度组分只允许两个不合格出现，所以根据具体情况酌情处理。

　　本网收录前沿Lab：第二炮兵总医院分析中心

　　报告下载：《第二炮兵总医院质谱检测中心简介及定量应用》

　　质谱校正和化合物鉴定的新技术——MassWorks及其应用

北京绿绵科技有限公司李卫健老师

　　来自北京绿绵科技有限公司的李卫健老师为大家带来了《质谱校正和化合物鉴定的新技术——MassWorks及其应用》的报告。

　　MassWorks是一个第三方的质谱软件，即支持AB、Agilent、Thermo、Waters、Varian等公司质谱的数据，可在低分辨的质谱上实现精确质量测定，帮助预测分子式;并在Q-TOF等高分辨质谱上提高分子式预测的准确度。

　　那么它究竟是什么原理呢?为什么TOF的分辨率比四极杆一般只高了5倍，而质量准确度却比四极杆高了几百倍?

　　李老师首先从经典公式和问题着手，将Cerno公司的这项技术娓娓道来。

　　目前单级四极杆质谱无法获得精确质量数的原因有如下两点：

四极杆质谱图的峰形不能达到理想的正态分布，从而很难判断真正质心的位置；
质量轴存在漂移，所以不能得到精确的质量数。

而MassWorks软件一方面通过对峰形的校正得到正态分布的峰形，再一方面通过一些标准物质来校正质量轴，从而实现在低分辨质谱上测量精确质量数。

　　接下来李老师详细介绍了MassWorks软件的工作流程。

用已知精确分子量的标准物质(和待测物的质量接近会更好)，采集Profile轮廓质谱图；
输入已知分子量，MassWorks会自动调用仪器采集的质谱图通过计算得到校正函数；
测定真实样品，采集其Profile轮廓质谱图；
用校正函数对实际样品的质谱图校正，峰形得到校正，并获得精确的质心位置，从而得到精确质量数。
软件自动预测候选分子式。在预测方面，由于构成化合物的每一个元素在自然界中的精确质量数是固定的，同位素分布在一定时期内也是固定的，因此每一个分子式都存在一个固定的精确质量数和固定的同位素分布的比例，MassWorks计算和预测时还考虑了同位素分布的影响因素，因此，将不仅对低分辨质谱，同样对高分辨质谱，只要能获得较好的同位素峰形，加上精确质量数，也会大大提高预测分子式的准确度。

　　李老师通过介绍一个真实的应用检测例子——MassWorks结合LC/MS准确测定奎诺酮类药物分子式，得出的实验结论是：

借助Massworks可以在低分辨率质谱上测定奎诺酮类药物的精确质量数，质量误差小于10mDa；
MassWorks的谱图准确度功能(考虑同位素分布)帮助我们实现在低分辨率质谱上奎诺酮类药物分子式的准确识别，位于待选目标物的第1位；
MassWorks操作简便快速;可随时对质谱采集的数据进行精确质量数的确定；
线性范围宽：100万～5000万信号强度；
无需频繁地校正仪器。

　　只要被测物质之间存在一定的理化性质差别，借助色谱可以将其分开或被测物质的质量误差相差在2Da以上、及质量数不一样的前提下，便可实现低分辨质谱+MassWorks = 具有高分辨质谱的功能。

　　MassWorks软件的应用领域十分广泛，包括有机合成产物或付产物的鉴定、降解产物的鉴定、农残的鉴定、代谢产物的鉴定、天然产品中有效化合物的鉴定等等。

　　现有用户包括国家烟草研究所AB质谱仪的用户;陕西、广东、宁波出入境检验检疫局、北京林业大学;上海白鹭制药等等。

　　结论：

高分辨质谱可得到化合物精确质量数通过适当的校正，低分辨质谱也能实现精确质量数测定，并得到分子式；
对于质量误差可达到100ppb的高分辨质谱仪在识别分子式时也不能得到唯一的分子式，结合MassWorks的谱图准确度功能(考虑同位素分布)可以帮助确认唯一分子式；
MassWorks让普通质谱实验室也可以实现精确质量数测定，并对分子式确认，扩展了现有仪器的使用功能；
成本低，使用快捷、方便；
由于该软件是一个第三方软件，所以广泛适用于AB、Agilent、ThermoFisher、Waters、Bruker、Varian公司的四级杆质谱，进行精确质量数的确定和分子式的识别，也可用于其高分辨质谱上帮助确认唯一分子式。

　　本网站关于MassWorks软件的博客：MassWorks分子识别

　　报告下载：《质谱校正和化合物鉴定的新技术——MassWorks及其应用》

　　GC-MS在助燃剂、爆炸物等高分子化合物的应用

公安部第二研究所仪器分析室徐建中老师

　　来自公安部第二研究所仪器分析室的徐建中老师给大家带来了关于《GC-MS在助燃剂、爆炸物等高分子化合物的应用》报告。

　　质谱技术在爆炸案、纵火案中，可以通过鉴定残留物来帮助推断事故原因，给消防或刑侦提供科学依据。

　　在检测未知化合物时一般的分析方法是：首先利用红外或扫描电镜来确定该物质是无机化合物还是有机化合物，如是有机化合物则做质谱分析，如在谱图库里检索不到该物质(概率为20%左右)，接下来就要对该物质进行分离，一般采用薄层板使未知物分离出来，采用化学源或液质联用技术确定分子离子峰，通过红外、紫外、高分辨质谱综合确定该化合物的结构。

　　在纵火案件中主要检测的助燃剂一般为轻质矿物油(汽油、煤油、柴油)。检测提取的方法很多如：

蒸馏法提取
溶剂提取
静态顶空提取
吸附解析提取
固相微萃取法

　　溶剂提取法如用正己烷、乙醚作溶剂时，但实际从现场获得的样品很复杂量又很少，如浓缩到100倍的话，浓缩后的物质很多都是苯系物、芳香烃类的物质和纵火剂完全相同，所以徐老师指出一般不采用这种方法，除非对所有样品进行蒸馏，去除干扰成分。

　　吸附解析提取法也存有一定的问题，如大气中的汽油同时含有很多苯系物、芳香烃，在进行动态吸附时会干扰检测结果。

　　最常采用的方法为固相微萃取技术，该方法在密封的条件进行加热吸附后直接进入色质检测，提取效率高，主要吸附轻质化合物如芳香烃、苯、二甲苯、三甲苯等等，该方法只能吸附到C15、C16，所以一般使用该方法检测汽油。

　　接下来徐老师为大家详细介绍了一个纵火案的现场，举例说明，如用固相微萃取法进行提取时，由于该方法只能吸附到C15、C16高碳数无法吸附，所以还要对化合物进行溶剂提取查看是否含有高碳量的物质，最终确定导火索是助燃剂还是现场其它物质。徐老师强调指出检测时一定要把被分析物质研究清楚，这样得出的结论才能正确。

　　在爆炸案中主要检测方向是确定炸药性质、炸药的来源、起爆方式等，为侦查破案提供依据。样品提取方法有：

溶剂提取
固相微萃取法
固相微萃取膜技术
超临界流体技术
加速溶剂提取技术

　　实际检测中一般常使用丙酮作为溶剂进行提取，在检测中炸药TNT一般使用30m的柱子，由于硝化甘油和一些黑索今易分解所以采用8m的短柱子分离，在质谱上分析炸药时一般采用负化学源，灵敏度相对较高。

　　Neurospora生物钟调控蛋白WC1、FRQ定量磷酸化分析

北京生命科学研究所蛋白质中心龙承祖老师

　　最后由来自北京生命科学研究所蛋白质中心的龙承祖老师为大家带了关于《Neurospora生物钟调控蛋白WC1、FRQ定量磷酸化分析》的报告，该课题是德克萨斯大学西南医学中心 Dr. Yi Liu 实验室与北京生命科学研究所蛋白质中心共同合作研究。

　　本实验主要应用¹⁵N进行标记，由于蛋白质的组成元素主要是C、H、O、S、N，在培养植物或微生物的时候，把15N的盐作为其唯一的N源，经过标记若干代之后，其原来体内的¹⁴N就全部被代谢为¹⁵N，这样该植物或微生物在质谱上就可区别于其它样品。

　　生物钟是生物体内一个24小时左右的生化，生理以及行为方面的节律。生物钟在动物，植物和微生物中广泛存在，对维持正常的生理周期起到重要作用。Neurospora中文名叫糙脉孢菌，是生长在面包上的一种红霉，该菌在每天中午的时候会释放孢子变成红色。该真菌调控生物钟的蛋白WC1、FRQ在人和哺乳动物里是相对保守的体系，所以有对其研究的必要性，也是研究生物钟的重要工具。

　　WC1是一个转录因子，结合在DNA上游区域，从而控制FRQ的转录，WC1被磷酸化之后蛋白质上会发生翻译后的修饰，当其受到外界刺激(如光或病原物)的时候被迅速修饰，具备了原先没有的功能。WC1被磷酸化之后结合到DNA的上游区域，转录成另外一个FRQ蛋白，该蛋白会把WC1降解掉。该报告主要研究的就是FRQ、WC1是如何实现生物钟的调控节律。

　　使用液质联用技术来研究FRQ磷酸化了WC1上的哪些位点，FRQ对这些位点启到那些作用。建立的实验方法是把一个Neurospora中的FRQ进行突变，则该真菌里就不存在FRQ蛋白，选用一种野生型的真菌用¹⁵N进行培养并标记，把FRQ的突变体用¹⁴N培养并标记，如果磷酸化不是受FRQ影响的话¹⁴N与¹⁵N的比例应是1:1的关系，如果是由FRQ引起的磷酸化从谱图上应该呈现¹⁵N的峰比¹⁴N的峰高。

　　最终鉴定得到了Neurospora生物钟重要调控蛋白FRQ的体内43个新磷酸化位点，其中33个为可能的体外磷酸化位点，得出S990和S995这两个位点的磷酸化不依赖于FRQ，是由PKA作为起始激酶磷酸化而得到的。

　　报告下载：《Neurospora生物钟调控蛋白WC1、FRQ定量磷酸化分析》

　　报告结束后，会议室里还一直洋溢着热烈的讨论氛围。大家对MassWorks和GC/MS技术如何应用于药物分析、代谢物鉴定; 蛋白质组学的同位素标记技术如何应用于其它方面的研究，都很感兴趣，也和专家们展开了持续的探讨。