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miRNA功能分析的五点建议
随着microRNA(miRNA)研究的深入，很多人开始从miRNA的发现转入功能分析。miRNA抑制是一种确定miRNA功能的强大技术。如何开展，需要注意些什么?Exiqon公司的专家给出了五点建议。
1. 选择合适的抑制剂
若希望miRNA功能分析成功，首先要选择一个最适合您实验的抑制剂。
• 检查您的目的miRNA是否属于可能的功能冗余的miRNA家族。如果这些家族成员在您的系统中表达，则您应当考虑抑制整个家族的家族抑制剂。
• 如果您正在研究非常高表达的miRNA或难转染的细胞，那么您应当考虑一些强力的抑制剂，如Exiqon的Power inhibitors。由于高稳定性，这些抑制剂适合需要长时间抑制的实验。
• 如果您正在研究一些容易转染的细胞，或不太能忍受强力抑制剂的细胞(如来自肌肉或中枢神经系统的细胞)，那么常规的抑制剂可能是更好的选择。
2. 优化您的转染
优化转染效率对提高miRNA抑制并降低副作用很关键。随着细胞类型和所使用的转染试剂不同，转染效率也会变化。当然，最佳的转染试剂和转染条件必须根据经验确定。如何优化?这里也许有您需要的答案(http://www.ebiotrade.com/newsf/2012-3/2012328173444787.htm)。
3. 开发一个分析来监控miRNA活性
在尝试分析抑制miRNA活性的后果之前，您需要确定oligo的转染已经实现了高效的miRNA抑制。因此，您需要开发一个分析，来监控miRNA的活性。通过功能分析，监控蛋白水平。或者，利用一个质粒，在报告基因(如萤光素酶)的3’ UTR插入miRNA靶点。不要使用miRNA qPCR!它容易产生假阳性结果。
4. 确定适当的量和开展表型分析的适当时间
所有寡核苷酸都是细胞毒性的，在高浓度时可能产生副作用。开展剂量反应研究，确定有效抑制miRNA时所需的最低浓度oligo。以此浓度来研究miRNA抑制的后果。记住，miRNA的功能可能只在有限的时间内是必需的。因此必须摸索转染的时间和表型观察的时间。实验过程应总是带有阴性对照，以评估转染的非特异影响。
5. 了解您的研究
充分了解通路和关键蛋白对解释miRNA抑制的表型结果很关键。Exiqon提供一个miRNA靶点预测工具，可列出大部分miRNA的数百个可能靶点。然而，挑战在于如何缩小这个范围。目前有一些生物信息学工具，可帮助您解释miRNA目标列表。一旦您创建了这个短的列表，您可以验证基因表达是否被miRNA抑制所去阻遏，从而确认这些候选靶点。下一个问题是这些靶点的去阻遏是否与观察到的表型相关。解决此问题的一种方法是通过LNA™ 反义oligo屏蔽miRNA靶点，防止miRNA与特定mRNA的相互作用，而不是抑制miRNA。这是一个好办法，可评估哪个miRNA靶点才是观察到表型的主要贡献者。
