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【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖
有战友询问SDS－PAGE电泳的问题，我想这是实验室比较常用的一个实验，就将战友的部分代表性问题集中起来，结合我的实验经验，整理了这个帖子。其中关于原理的部分主要是参考了郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》一书。水平有限，不妥之处敬请指正。同时希望广大战友在看完后，把贴中未列出的一些其他问题贴出，以备以后集中整理。【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖
Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？
A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？
A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
Q：样品如何处理？
A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍；
TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
Q：为什么带出现拖尾现象？
A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
Q：为什么带出现纹理现象？
A：主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
Q：什么是“鬼带”，如何处理？
A：“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？
A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
Q：为什么电泳的条带很粗？
A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；
Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：电泳槽正确装配即可。
Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
处理办法：按正确的操作方法操作。
请大家多多的顶！
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【讨论帖】SDS-PAGE电泳求助专用帖
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最新回复
IAM007 (2013-6-27 15:24:11)
阿敏 (2013-6-27 15:24:34)
顺便问一下楼主，我的电泳条带为什么呈纺锤形呢？染色后条带呼啦拉一大片，看不清楚？
ukonptp (2013-6-27 15:25:00)
QUOTE:
应该是样品过量了，一样的蛋白量在特定位置聚集过多，导致聚丙酰胺凝胶被涨破形成的damingxia0904 (2013-6-27 15:25:19)
ukonptp (2013-6-27 15:25:45)
QUOTE:
没明白你所说的挤碎是什么意思，不过从你描述的结果来看，还是比较正常的，条带淡主要与你的样品蛋白浓度有关，适当增加上样量试试；溴酚蓝的带应该是所有的孔都连在一起的吧？那可能与你buffer中的溴酚蓝加的过多，或样品处理时buffer加的过多有关。所以，你只需按照既定的比例加就可以了。比如10ul的样品＋5ul的2×buffer即可！yjf1026 (2013-6-27 15:26:05)
还有我始终想不明白，蛋白加入SDS变性后就不会降解了吗？提取蛋白时始终要在4度进行，最后上样前的沸水浴蛋白就不会降解?
ukonptp (2013-6-27 15:26:38)
QUOTE:
1、你用的2×buffer是什么配方，能否贴出来？我用的是分子克隆上的，溴芬兰都是直接加在里面的。2、你的蛋白如果是不可溶性蛋白，你可以加一些助溶剂试试。
3、样品稀的话，可改用4×buffer或5×buffer，这样尽可能的在每孔中多加些样品。
4、在buffer中有两样重要的东西，一是sds，非极性去垢剂，主要作用是中和蛋白质分子表面的电荷，打开肽链间的氢键，破坏蛋白分子的高级结构。另一个是dtt或Beta巯基乙醇，破坏肽链间的二硫间，使蛋白分子变成线性肽链。但只是蛋白的天然构象被破坏了，变成了线性结构，并没有降解。在外界环境变化时（比如变性剂消除的时候），蛋白分子还可一定程度的复性；降解是使蛋白质分子变成小肽或氨基酸分子，此时的蛋白是不能再次复性的。所以降解和变性这两个概念是不一样的。
但是在变性的过程中，蛋白质是有一定降解的。比如我们在提取蛋白时的反复冻融、室温放置过久，都会有一定的影响。不过这些都不是主流，主流还是变性。因为蛋白质的降解，归根结底是肽键的断裂，而这一过程不是凭空产生的，要有蛋白水解酶的参与才可快速完成。而4度或沸水，酶的活性都是很低或没有活性！所以不必担心。
zranqi_1 (2013-6-27 15:27:02)
我有一个问题：我们的电泳用的是恒流：20mA，需要大约8个小时，才能结束，正常吗？临近实验室的用恒压，一般都2、3个小时就结束了。
电泳缓冲液是否应当调整pH值？分子克隆上说的是8.3 ，但是我调整之后，电泳速度更慢，需要十个多小时，不知道原因，请楼主帮忙.
IAM007 (2013-6-27 15:27:37)
"sds，非极性去垢剂"
的说法不妥。应该是离子型去垢剂。
DTT不只破坏肽链间二硫键，也破坏链内二硫键。
蛋白降解在极端pH下也可以发生，不一定非要酶的作用。
ukonptp (2013-6-27 15:28:11)
QUOTE:
要8个小时确实有点长了，我一般用恒压，浓缩胶50-80v，分离胶100-120v，最多3－4h。一般pH是要调的，不过我们实验室直接按分子克隆上的配方配过后，直接用效果也挺好的。
不过影响电泳速度主要有两个原因，一个是电压或电流，还有一个是离子浓度，所以你可着重在这两方面找原因。比如你可以增加你的电压或电流试试！若还有问题，可上来跟贴！
6327555 (2013-6-27 15:30:12)
谢谢楼主，搞这个讨论版。我这段时间长期跑SDS-PAGE，遇到很多问题。想问一下waynepionnet ，恒压和恒流跑出的胶有没有差别。
star#room (2013-6-27 15:47:00)
非常感谢楼主的帖子，受益匪浅。请教一个关于蛋白质降解的问题，按照您的说法，如果用诱导表达后直接收菌加buffer上样电泳，蛋白质是不是就不会被蛋白酶降解（在保证pH值的情况下）？那么超声破菌之后再煮沸上样会不会降解？因为感觉超声破菌之后会有蛋白酶的释放，这一过程是否对蛋白有影响？谢谢啦
vera+ (2013-6-27 15:47:19)
谢谢楼主精彩的总结。但是其中有一个地方不是很妥当。
十二烷基硫酸钠（sod.dodecyl sulfate,简写为SDS）,又称月桂基硫酸钠
（sod.lauryl sulfate,简写为SLS），其分子式为CH3(CH2)10CH2OSONa；分子量为288.38。
十二烷基磺酸钠（sod.dodecyl sulfonate,简写亦为SDS）,分子式为CH3(CH2)10
CH2SONa；分子量为272.38。这两种物质都是阴离子表面活性剂，其中十二烷基硫酸钠是常用的生化和免疫实验用试剂，而十二烷基磺酸钠因其制造及性能上的一些缺点，几乎没有在医学、生物学实验室使用。我国的《化学试剂国内外标准手册》以及国外著名试剂公司如Sigma,Aldrich和Fluka等的产品目录也都没有收载。目前常见的错误是，将本该是十二烷基硫酸钠的说成是十二烷基磺酸钠。
ukonptp (2013-6-27 15:49:33)
ukonptp (2013-6-27 15:49:55)
2、那么超声破菌之后会有蛋白酶的释放，这个会让蛋白质降解，所以在超声时一般洗脱液中都添加蛋白酶抑制剂，所以不用太担心这个问题。至于煮沸是不会让蛋白降解的。
ritou1985 (2013-6-27 15:50:17)
ukonptp (2013-6-27 15:50:44)
QUOTE:
你跑的是什么蛋白呢？可以把你的图贴上来看看吗？ritou1985 (2013-6-27 15:51:22)
1为诱导前，2为诱导后，3为Marker；依次为116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18.4抗kD。312个aa，不是天然蛋白，是人工蛋白。
33942533.snap.jpg
ukonptp (2013-6-27 15:51:46)
你用什么载体表达的，你有没有把载体蛋白得分子量算上？
ritou1985 (2013-6-27 15:52:09)
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