查看完整版本请点击这里：
【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会
【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会
最近在做原核表达，包涵体。以前也做过，但经验不多。从园子里也学到不少。一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正
1. 首先介绍一下背景。载体是novagen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。
2. 第一次失败。第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。PCR，酶切都正确。但没等测序结果出来就开始做了。失败了。曾在园子求助。后来证明是引物错误。我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。
教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。
3. 第二次失败。后来重新构建，转化，诱导。第一次诱导时根本就没带。见附图（图片质量太差了，sorry，下面几个帖会逐渐好转。我们都在失败中提高，进步，不是吗）
然后开始找闷头原因。周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！
我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的Amp。对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。
当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。
这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp抗性的时候要格外注意。
查看完整版本请点击这里：
【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会
【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会
70838749.jpg
最新回复
ukonptp (2013-4-19 13:20:48)
4. 第三次做诱导就格外小心了。首先，晚上12点我才接菌，到第二天早上就开始转接了。这次用的是100 ug/ul的Amp浓度。转接的时候是1:500稀释。（我不知道1:100行不行，一朝被蛇咬，十年怕井绳啊。在OD600达到0.8的时候诱导。
转接的时候做对照：IPTG 0 h，
同时做诱导：2 h, 3 h
结果见附图。图注的大概意思：
从左到右的泳道依次是：阴性对照，诱导2 h，诱导3 h；由于我做的是包涵体，所以前面点的都是沉淀，16，17点的上清。但这两个泳道太难看了。后面的胶会好一点，sorry
主要结果有三：
A. 有表达，
B. 阴性对照也有表达，所以这个结果不是很convincing
C. 目的蛋白应该在30 kD，但分子量显示是36 kD左右（这个问题是个低级错误，接下来的帖子会指出）。
原因分析：
为什么阴性对照会有带？我想起表达毒性蛋白的protocol. 表达毒性蛋白的时候，由于DE3可能根本就不长，或者长得很慢，这时候我们会在培养基中加glucose。当培养基中有其他首选碳源，如glucose时，细菌会优先选择glucose，而glucose会抑制cAMP的活性从而关闭乳糖操纵子。
为什么要加入glucose呢？我们用的DYT或者LB培养基中含有丰富的tryptone。后者可能含有微量的乳糖。所以虽然没有加IPTG，其中的lactose同样可能诱导蛋白的表达。这样毒性蛋白在加IPTG前就开始表达了，杀死或者抑制了细菌的生长。
那么我的这个实验中，阴性对照出现的带是不是也是因为这个原因引起的呢？
为了验证，进一步做了实验，结果见下一贴。
40837764.jpg
ukonptp (2013-4-19 13:27:18)
要验证阴性对照中的带是不是由于培养基中的微量lactose的，可以做如下实验，
A. 测培养基中乳糖含量；
B. 购买无乳糖培养基；
但是我不愿浪费时间在这上面。。。卖个关子哈
实际上，我做了如下的一组处理：
a. 阴性对照＋2％glucose
b. 阴性对照 without glucose
c. 诱导2 h
d. 诱导3 h
这个处理其实存在设计上的错误。如果要得出严谨的结论，应该要加一个2％glucose的诱导处理。这样，预期的结果就是：
a, 无目的条带，
b, 有目的条带，但不够多，
c, 有
d, 有
e, 2％glucose, 诱导，无目的条带或者仅有很浅的带。
很抱歉，e没有做。那天很久没用的两瓶glucose中的一瓶被污染了。。。
结果见附图。
图注的大概意思：
从左到右的泳道都是按a, b, c, d处理排列的。5－8以及13－16泳道是positive expression control。是pET15b携带b-galactosidase的一个构建。泳道1－8是全细胞蛋白电泳；泳道9－12是取沉淀电泳；13－16是上清电泳。结果：
a. 有glucose的阴性对照无带（或非常浅）
b. 无glucose的阴性对照有带，但整体来说比诱导的弱
c. 诱导的有带
d. 蛋白大小还是不对（其实是对的，我冤枉它了，请看后面的帖子）。
结论：培养基中确实很可能存在lactose。而且应该是造成阴性对照有表达的原因。
30859696.snap.jpg
ukonptp (2013-4-19 13:27:45)
头痛
现在头疼的就是分子量的问题了。
首先，切胶做MS。见附图。那三个洞洞就是偶挖滴
根据公司的报告，这个蛋白就是我们要的蛋白。
然后就开始怀疑分子量marker了。
细心的战友可能发现了，我下面这个图marker其实跟上面几个图都是一样的，但标的不一样了。这就是我说的低级错误：
我之前的图是按Tris-HCl buffer，12％的胶标的。但我跑的Bis-Tris胶，而且是MES buffer。而marker在这两种buffer（胶）中所代表的分子量是不同的。有兴趣的战友可以查看下帖中的pdf文件。
92803121.jpg
雪山飞鹿 (2013-4-19 13:28:15)
做实验吗，犯错误是难免的，最重要的不是去郁闷，而是想办法如何分析和解决问题
bs4665 (2013-4-19 13:28:45)
还有版主的阴性对照好像含有目的片断是么？ 作诱导表达为什么不做一个空载体作诱导呢？这样直观一些，而且可以分清该蛋白是否为细菌的本底表达。跑PAGE时沉淀和上清最好是分开跑，除非你重容沉淀时用和上清同样的BUFFER，否则它会影响带跑出的效果。
恭喜版主所在的实验室有这么好的条件，祝实验顺利！
以上是我个人的一点想法，望各位大侠赐教。
bs4665 (2013-4-19 13:30:05)
还有版主的阴性对照好像含有目的片断是么？ 作诱导表达为什么不做一个空载体作诱导呢？这样直观一些，而且可以分清该蛋白是否为细菌的本底表达。跑PAGE时沉淀和上清最好是分开跑，除非你重容沉淀时用和上清同样的BUFFER，否则它会影响带跑出的效果。
恭喜版主所在的实验室有这么好的条件，祝实验顺利！
以上是我个人的一点想法，望各位大侠赐教。
qiangren789 (2013-4-19 13:30:45)
第二点也很重要，阴性对照就应该是dada2006说的这样，还可以加上空白对照：原始菌种，以及阳性对照：已知目的蛋白，就更为完善了
祝好！
ukonptp (2013-4-19 13:31:09)
至于marker看实际蛋白的分子量，相对MS来说肯定是粗略，但结果仍然是可信的。不同公司的marker，只要其中每条ladder的蛋白是同一个东西，比如BSA, Lysozyme等，应该都是一样。而且公司会有说明的。需要注意的是自己的buffer是不是公司所指出的buffer（之一）。
鉴定目的蛋白，测序是比较贵的。我认为MS identification已经足够。如果测序正确，对照严格，大小正确，可以初步确定目的蛋白的表达；
同意您的意见，western or Elisa是进一步鉴定蛋白的常用办法。
我的阴性对照是含有目的片段的。确实缺少一个空载体的对照。严格的说，还应该有个不含任何质粒的DE3全蛋白电泳对照。但我当时就拿positive expression control的当没有含我需要表达的目的片段的negative control了。您可以比较一下，positive control的泳道里是没有这条带的。有偷懒的成分在里面但实验成本也确实有点高了，呵呵。
您说的上清沉淀分开跑的问题我真没仔细想过。多谢了。
希望以后能有更多机会与您交流，共同进步！
yjf1026 (2013-4-19 13:31:34)
提个小小的笔误
pET应该是Novagen的原核表达品牌
子衿青青 (2013-4-19 13:32:21)
LZ确实细心。以前做过很长时间的表达，与LZ比较起来，真实惭愧，很多问题都没有细细钻研，往往想当然认为怎么样怎么样了。所以谢谢LZ，一方面是这么细致的心得，另一方面是对待实验中出现的问题的钻研态度哈。
子衿青青 (2013-4-19 13:34:40)
LZ确实细心。以前做过很长时间的表达，与LZ比较起来，真实惭愧，很多问题都没有细细钻研，往往想当然认为怎么样怎么样了。所以谢谢LZ，一方面是这么细致的心得，另一方面是对待实验中出现的问题的钻研态度哈。
分子式 (2013-4-19 13:35:18)
tianmei001 (2013-4-19 13:35:45)
转接的时候，需要那么小的比例呀，都１／５００！？我做的是kan抗性，用１／１００（按制备感受态的要求做的），行吗？我问别的同学，还用过１／２５呢，要求严格吗？
ukonptp (2013-4-19 13:41:06)
Amp的问题在首贴里已经提了。
谢谢讨论
@STAR@ (2013-4-19 13:42:48)
对你的这个问题我想发表一下自己的想法，你培养基中的乳糖含量应该是微乎其微的，而且即使有微量的不足以引起诱导表达。我认为你的阴性对照中的表达蛋白是你在上样的过程中溢出来的。我曾经作出过，阴性对照和阳性菌株蛋白图谱完全一样的电泳图。最终试验结果证实，主要是上样品的过程中不够细心，溢出造成。
再一个就是，你要做一个空表达载体的阴性对照，更有说服力。
@STAR@ (2013-4-19 13:43:10)
==============================================================================================================
对你的这个问题我想发表一下自己的想法，你培养基中的乳糖含量应该是微乎其微的，而且即使有微量的不足以引起诱导表达。我认为你的阴性对照中的表达蛋白是你在上样的过程中溢出来的。我曾经作出过，阴性对照和阳性菌株蛋白图谱完全一样的电泳图。最终试验结果证实，主要是上样品的过程中不够细心，溢出造成。
再一个就是，你要做一个空表达载体的阴性对照，更有说服力。
ukonptp (2013-4-19 13:44:41)
关于前面的问题，
1. 我用的是DYT培养基，比LB中的tryptone含量高一倍。
2. BL21 Star DE3是一种优化的表达菌株，invitrogen网站上有一张图片，用该菌株做表达，产量要高于未突变的DE3，因为前者是某（些）蛋白降解酶的突变菌株。
3. T7 promoter 具有很强的可诱导性。在表达毒性蛋白的时候常用到glucose或者pLysE 菌株。前者抑制蛋白的本底表达；后者能产生一种酶使得在T7 promoter控制下的基因表达得到抑制。这些都是因为培养基能诱导一些本底表达。
所以，您用的是什么菌株呢？表达量跟菌株，外源片段，加IPTG的时间等等都有关系。从图上您可以看到，我这个蛋白的表达是非常高的。除了加入的lysozyme （14k 左右的那条带），目的蛋白在总蛋白中的量恐怕要达到80％了。所以微量的lactose很有可能诱导出较多的蛋白。
关于漏样的问题。胶上有说明，18 wells，30 ul。我都是点10 ul样。另外，同样的操作，在第三张胶图中看不到漏样的现象。(可以比较positive control旁边的带）。
Anyway，我的这个结论缺乏直接的证据。所以我用的描述是”培养基确实很可能存在lactose，而且应该是造成阴性对照表达的原因“。
要证明这个问题，可以用不含tryptone的培养基，比如Minimal培养基和DYT做个对比。这样也能说明问题。也许等下次做蛋白表达的时候会考虑做一个，到时候再把结果贴上来
再次感谢您的讨论。
dongdongqiang (2013-4-19 13:45:01)
ukonptp (2013-4-19 13:45:32)
多谢
===============================================================================================================
表达毒性蛋白也有不同的毒性level。园子里关于毒性蛋白表达的帖子肯定不少。
一般的来说，将菌培养到高OD（要用丰富培养基，比如TB），OD600到4-5，甚至有人做14-16的，然后用低浓度IPTG短时间诱导（如0.4 mM 1 h）。具体的最优化条件，我认为不同的蛋白应该摸索不同的条件（诱导时细菌状态，时间等）。
也可以用表达毒性蛋白的strain，很多公司都有卖的。如BL21(DE3)pLysS.
@STAR@ (2013-4-19 13:46:17)
1. 我用的是DYT培养基，比LB中的tryptone含量高一倍。
2. BL21 Star DE3是一种优化的表达菌株，invitrogen网站上有一张图片，用该菌株做表达，产量要高于未突变的DE3，因为前者是某（些）蛋白降解酶的突变菌株。
3. T7 promoter 具有很强的可诱导性。在表达毒性蛋白的时候常用到glucose或者pLysE 菌株。前者抑制蛋白的本底表达；后者能产生一种酶使得在T7 promoter控制下的基因表达得到抑制。这些都是因为培养基能诱导一些本底表达。
所以，您用的是什么菌株呢？表达量跟菌株，外源片段，加IPTG的时间等等都有关系。从图上您可以看到，我这个蛋白的表达是非常高的。除了加入的lysozyme （14k 左右的那条带），目的蛋白在总蛋白中的量恐怕要达到80％了。所以微量的lactose很有可能诱导出较多的蛋白。
关于漏样的问题。胶上有说明，18 wells，30 ul。我都是点10 ul样。另外，同样的操作，在第三张胶图中看不到漏样的现象。(可以比较positive control旁边的带）。
Anyway，我的这个结论缺乏直接的证据。所以我用的描述是”培养基确实很可能存在lactose，而且应该是造成阴性对照表达的原因“。
要证明这个问题，可以用不含tryptone的培养基，比如Minimal培养基和DYT做个对比。这样也能说明问题。也许等下次做蛋白表达的时候会考虑做一个，到时候再把结果贴上来
==========================================================================================================
谢谢！
在诱导中，乳糖会被不断的降解，这也是我判断培养基中微量的乳糖不会影响诱导的原因。你已经表达出来了，这个问题就不值得深究了。
祝你试验顺利
【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会