【求助】半定量RT-PCR究竟能不能准确定量

最新回复

• xue258 (2015-7-02 16:21:16)

  
  realtime好贵的！

• vcve (2015-7-02 16:21:35)

  
  仅仅定量，做个斑点杂交就可以了。我觉得比Northern方便准确，因为Northern过程中RNA降解是在所难免的，多少会有点。斑点时间短，操作容易呀。

• shenkunjie (2015-7-02 16:21:56)

  
  补充一点，NORTHERN和DOT不是都能用的，如果你的目的蛋白基因表达很少，只能用PCR，而且要发文章，REAL TIME才好说话。是贵，也是无法替代的。

• tudou85 (2015-7-02 16:22:13)

  可是半定量我已经做完了
  但是统计方法实在搞不清用什么，哪位高手指点一二！
  谢谢了！

• wu11998866 (2015-7-02 16:22:32)

  我老板让我探讨一个酶在病理情况下的表达变化,因为此酶的抗体找不着,我就用RT-PCR的方法探讨其在转录水平表达的变化.做了后,我才发现结果不稳定,且影响因素太多.现在是浪费了金钱和时间依然没有结论.所以,建议大家今后做RT-PCR前慎重考虑.如果你只是想定性分析,RT-PCR尚可;但定量,最好选用及时定量PCR.

• yonger (2015-7-02 16:22:57)

        使用RT-PCR半定量，那么首先您需要多重复几次（最少3次），然后将目的基因和内对照的比值以均值+/-标准差的形式记录下来；其次要看您的实验设计了，象foliage兄探讨一个酶在病理情况下的表达变化，如果是3种不同的病理情况，则每个病理情况下都需要做至少3次RT-PCR，记录目的基因和内对照的比值，采用方差分析法（多半是正态分布计量资料）比较不同病理情况下的比值不同，比较同一病理情况下不同时间的变化也是如此；如果是比较大的样本，如40个肺癌标本，采用RT-PCR法检测VEGF和FGF的表达情况，然后比较它们的相关性，可采用直线相关法（偏态资料采用秩相关分析）。
         当然还有其他情况 ，小弟在统计方法方面小有研究，如果您有什么问题，可以跟帖讲清楚一点您的实验设计和目的，大家一起讨论。
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• zhy平平 (2015-7-02 16:23:20)

  在用分析RT-PCR条带的图象分析软件时，操作者的主观性也是影响结果客观准确的一个重要方面。

• dhpbj (2015-7-02 16:23:39)

  刚查悄悄话才发现您的回复，不好意思
  我在其它文献中也有见用均值+/-标准差的方式表示的，可就是不懂：既然是目的基因和内对照的比值就应该是以几何均数表示，怎么求其均值呢？
  twig兄讲的也很有道理
  多谢两位指教
  注：我是新手，不要称为兄吧。

• yonger (2015-7-02 16:24:39)

  目的基因和内对照的比值就应该是以几何均数表示，怎么求其均值呢
  
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        没想到一个月以前的帖子还能再看到，我记得这个帖子是我在专业版块中得到的第一分，真是美好的回忆！再次感谢主任！
        谁说新手就不能称为兄了，其实每个人都各有所长，您在其他方面说不定就比我们强很多呢，而且，我进实验室还不到1年，也得算新手。
        现在就您的问题讨论一下：
        1.您怎么会想到几何均数的？平均数（average)包括算术均数（简称均数）和几何均数，二者都是重要的集中趋势指标。算术均数主要用于表示正态分布资料的集中趋势，几何均数主要用于表示某些偏态分布资料的集中趋势，后者主要包括两种情况，一是等比数列资料，即各变量之间呈倍数或近似倍数关系时，如抗体的滴度等；二是对数正态分布的资料，如疾病潜伏期等。目的基因和内对照的比值您看符合这两种情况吗？
        2.由于半定量RT-PCR这项技术不能准确定量，因此要多重复几次，所得的结果才最接近真值，最少也得3次，重复的越多，结论肯定也更准确。根据个人经验，我认为目的基因和内对照的比值尽管有所变动，有时侯甚至挺大，但总体来说还应该认为是正态资料，所以用算术均数+/-标准差的形式来表示我觉得比较合适。
         您觉得我说的有道理吗？若否，请跟帖讨论。

• bs4665 (2015-7-02 16:25:00)

  
  实时荧光定量当然很好，但限制很多，如标准物等。
  我想测VEGF，如果用实时，不知有VEGF标准品卖吗？如果没有标准品我又该如何测呢？价钱怎样，请指教。

• S6044 (2015-7-02 16:25:20)

  
  相关疾病：
  做RT-PCR的人确实很多，我也算是做了近8个月了，做出的条带虽然非常的漂亮，但感想是，这项技术定性还凑和，半定量就不行了。首先是内对照和目的基因之间多少存在竞争，其比值本身就不宜定量；第二，结果不能重复，我做了很多次，发现相同的RNA、不同RT-PCR产物的半定量结果极不稳定，就算是同一管PCR产物，扫胶后结果也各不相同，甚至可能差别很大（我们实验室的仪器设备是全国领先的）。
         因此鄙人愚见，这一方法不宜定量，以后各位同仁要是想在RNA水平进行定量的话，强烈推荐real-time定量RT-PCR和Northern blot，为了您的实验更加准确，最好不要半定量RT-PCR，以前没做过的时候觉得后者很好，做了之后才发现不是那么回事，这也花了大量的经费和时间啊，所以向各位介绍我的经验，以供想做半定量RT-PCR的同仁们参考。
  fengyouxin 战友是站着说话不腰痛，饱汉不知饿汉饥！你有那么好的条件别人有吗？RT-PCR用于半定量已有相当长的时间了，你的结果不行就能推翻整个学术界的做法？其实，RT-PCR用于半定量有很多条件需要优化。只有在充分掌握这些条件的基础上才能实施。

• bs4665 (2015-7-02 16:25:39)

  我们实验室的条件确实不错，但可能是因为我们的技术平台不够过硬，所以才造成这种不稳定的结果，而国内的现状就是这样，我想很多实验室的半定量RT-PCR结果也不会太好，您能同意吗？
  关于RT-PCR用于半定量有很多条件需要优化的问题，我们也非常的想了解，我们实验室的人绝大多数都是临床出身，以后绝大多数也要回到临床，对于分子生物学也是只知其一，不知其二；只会操作，原理就懂那么一点；每个人手上只有那么“三板斧”，搞不定也就算了；我来专业版块的主要目的也是向大家学习的呀，我灌水不多，但相关的帖子看的可不少。所以，能否请Fang CY兄不吝赐教，我知道您是基础出身，底子厚，能否将您对半定量RT-PCR进行优化的经验介绍一二，不胜感激！在这里我也代表我们实验室的同仁向您预先表示感谢，如果您的经验确实可行性强而且有助于改善结果，那么我和我们同学的实验结论将会更加可靠，今后发表文章、参加会议说话底气也更足，而且对我们以后的科研工作也将具有极其重要的意义，拜托您了！

• S6044 (2015-7-02 16:25:59)

  发上面帖子的主要目的在于: 对于学术上的东西,我们可以积极发表自己的观点和见解,但前提是你在充分了解情况、有大量准确可靠的证据的基础之上。你一个人的经验是有由你所在环境决定的，不能一点代面。在论坛上发表意见也要考虑到这一点，否则的话，会遭到群起而攻之。现在的学术界，特别是有些年轻人，以为自己所处的实验环境条件好，老板有名气就趾高气扬、忘乎所以。你的实验条件在全国领先，那拿到国际上比一比如何？国际上很多文章不还在用RT-PCR半定量吗？有real-time固然好，但没有呢？我现所在的实验室，相信绝对比老兄的条件要好很多很多，信不信？你老板有上亿的经费吗？你老板拿到过NIH的课题吗？呵呵。
  话归正转：RT-PCR人人都会做。但要做到能反映真实结果却并不容易。从你所说的 “就算是同一管PCR产物，扫胶后结果也各不相同，甚至可能差别很大”就说明你在操作上存在问题，或者不能真确使用软件。对于一个实验新手来说，由于实验操作的作风、习惯都没有定型，甚至存在操作不正确的情况，在这样的条件下，实验之间的可重复性肯定很小。我对临床学生的实验作风还是有所了解的。许多外科的学生在做实验时，就象锯病人的大腿！三下五除二就搞定。至于实验条件的优化，是每个人在一定实验环境中长期总结形成的，并不一定能推而广之，但有下列几点是肯定的。在抛开加样等各种误差的情况下，你必须做到：1. 在只加内参和目的基因引物的情况下，测定到达平台期的循环次数；2. 在同时加二者引物的情况下，做系列不同循环次数的扩增，以找出最适循环次数。注意，每次PCR时，模板的量必须固定。对于一些低丰度mRNA，为防止内参过早达到平台，可在目的基因扩增适当次数后再加入内参模板。
  其实，我也非常赞成用Northern，我们也不能否定RT呀！

• yonger (2015-7-02 16:26:40)

  其实我们实验室与临床挂钩密切，应该无法同老师的相提并论，我们的老板们的名气也都体现在临床上，其实我发这个帖子前也请教过本院另一个资深研究所的同学，才得出了这个悲观的结论，那个研究所有没有拿到上亿元的经费我也不知道，但有两位首席科学家，技术方面还是相当过得去的。
  其实我在PCR方面也费了不少精力。我也曾把目的基因和内对照同管扩增，从20做到38个cycle（相隔3个cycle)，最后选择了25个cycle，按您的意思，是否应该分别做单管扩增后，分别测定到达平台期的循环数；然后从中选择，再同管扩增，继而选择一个合适的循环数呢？这点我一直没搞清楚。
  还有我是两步法做RT-PCR，每次PCR时，模板的量必须固定这一点我也没能做到，我一开始每次都测RNA浓度，当然我们测定的方法可能不正确，老师和同学们也都说机器不准，有时我测得RNA的纯度高达2.79，但PCR的条带很好，有时测定的纯度1.9，PCR做不出条带，反正我们测的有问题，最后我RNA抽得比较熟练了，索性不测浓度了。您说的PCR控制模板量是否就是指在RT过程中控制RNA加入的量，使其一致。我觉得两步法牵涉步骤太多，控制了RT也控制不了PCR，一步法控制一下倒还可以，您同意吗？
  此外电泳后我们有专门一个技术员为我们扫胶，有一次我把相同几管PCR产物扫了两次胶（相隔3天），比值确实不同，第一次都在0.5左右，第二次都在0.9左右，我真是不知道怎么办了，因为胶的浓度、电泳液、电泳时间和加样的量都是一致的，Fang CY老师您看是什么原因啦？
  我们的分子生物学水平确实差，发这种帖子并非有意混淆视听，只是想有更多象您这样的老师肯指导我们，说出外行话来您也别见怪，我们的基础相差实在太大了。以后还得多请教您，麻烦了！

• S6044 (2015-7-02 16:27:18)

  
        RT-PCR用于半定量，国外一般都用分管扩增，而国内人士为了方便用单管扩增，这在一定程度上导致内参和目的基因的竞争，但考虑到竞争在所有实验组内都会存在，所以，如果控制好的话，还是可以进行的。但由于内参很容易达到平台，而在有些情况下，目的基因的丰度是不确定的，有些基因在20个循环可看到很亮的条带，可有些需要更多的循环才能被检测。所以，有必要在正式实验前，分管扩增内参和目的基因，以确定其相对丰度；然后同管扩增，分析二者之间相互影响的情况以及分析同管扩增的可能性。当然RT-PCR确实不能象real-time那样较为准确的定量，但如果你的实验因素确实对基因的转录有影响（当然不是很小），还是可以反映出来的。模板的量是非常重要的，你虽然用某一次提取的RNA做了循环次数的优化，但从你的测定RNA的结果看，确实存在问题。两步法虽然不宜控制摸板的量，但我们也要尽可能的去控制。你每次连RNA的浓度都不测，我认为这是导致你实验不可重复的重要因素之一。标本，特别是培养细胞，其目的基因的表达，初了受你的处理因素的影响之外，其他因素，如培养基、培养条件等对内参和目的基因的表达也是有影响的，并且我认为对二者的影响是不同的。在不同实验中，这些因素我们是不可能作到完全相同的，即使你认为相同。每次提取的RNA浓度肯定不同，内参RNA和目的基因RNA的比例也可能不同，因此，严格的说，每次重复实验前都要做一个循环次数这一重要参数的优化。因此，建议你还是每次测一下浓度。
         “老师和同学们也都说机器不准，有时我测得RNA的纯度高达2.79，但PCR的条带很好，有时测定的纯度1.9，PCR做不出条带，反正我们测的有问题”，这句话说明了你们的仪器确实有问题，我也开始怀疑你们的实验室是否真的在国内领先（做过调查吗？还是推测？），哈哈。首席科学家只能在一定程度上说明此人理论水平不错（况且好多专家是靠吹牛、关系、剽窃等手段发家的，在丁香园里经常看到披露这样的文章），并不能代表此人实验水平如何。象中国CDC的病毒所怎样？院士一大堆，按照老弟的推理，他们的实验室应该是一流的？可恰恰相反！他们穷的要命，所以，这次被SARS打的大败！给中国人丢了大脸！
       至于你的胶扫描的问题，我想我没有发言权，因为我没发亲自考察，研究。
      很高兴与你探讨问题，这也让我获益非浅。

• yonger (2015-7-02 16:27:40)

       所谓“听君一席话，胜读十年书”我想也就是这样吧！其实这个帖子是我刚进丁香园时发的，当时不懂事，现在我肯定不会再发这样的帖子了，我已经把楼顶的帖子修改过了，以免影响部分不明真相的群众。
        不过我已经把实验第一部分的RT-PCR做完了，再改已经来不及了，何况我现在的WB进行的很不顺利。当时因为结果不稳定，重复了好几遍，就是希望能做的更接近真值一点，要是早来丁香园，聆听教诲就好了。
         我们实验室的分子生物学技术水平确实不行，但环境不错，经费不愁，仪器也都是进口的（我们测核酸浓度的仪器是Bio-rad的），但苦于没有名师指点，操作上也是一代传一代，有时侯就是以讹传讹，比方说我这样忙活着测平台期，同学们已经觉得多此一举，人家说多了，自己也觉的是不是没有用处，在浪费时间（我一共做3个指标，光这个过程我花了两个多月，其中还出了不少问题）。
          我们还有一个误区：我们不是为了方便而进行同管扩增，而是认为单管扩增不能反映目的基因和内对照的比值，谁要是做单管的PCR扩增半定量我们反而觉得不对，我们看的一些国外文献中也是以同管扩增的居多，一直弄不清楚，前一阵看到eeflying兄说过半定量RT-PCR以单管扩增为好的问题已经讨论过，可搜索了半天楞是没找到，急！能否请各位老师从理论到操作所需注意的事项详细的讲一下？比如说是否单管扩增就一定要目的基因和内对照的循环数相同？要是分管扩增真的更好那反而好办了，因为在操作上，同管扩增的条件往往要比单管扩增来的难。
        再次感谢Fang CY老师的指导，真是长见识，今后还得再麻烦您！

• S6044 (2015-7-02 16:28:47)

  
  好的仪器如果管理和保养不善,就不会体现其优点.我曾见过这样一个很牛的实验室:上百万的流式细胞仪放在一间连基本装修都没有的房子里,上面落满了灰尘,门经常几天开着没人关,地上放满了垃圾,其环境与猪圈没什么区别!(这不是在编造)你说用这样的仪器测出的结果可靠吗?
  关于RT-PCR单管还是分管的好,可能仁者见仁.但我认为还是分管好,排除了内参与目的基因的竞争和内参易达到平台期的问题.我内参可以扩15个循环就结束,而目的基因可以扩25个循环,使二者都能控制在指数增长期.我看过的很多文章都是分管. 但单管扩增也可以在先使目的基因扩增10-15个循环后,再加入内参基因,继续扩15个循环.

• 969 (2015-7-02 16:30:22)

  我们还有一个误区：我们不是为了方便而进行同管扩增，而是认为单管扩增不能反映目的基因和内对照的比值，谁要是做单管的PCR扩增半定量我们反而觉得不对，我们看的一些国外文献中也是以同管扩增的居多，一直弄不清楚，前一阵看到eeflying兄说过半定量RT-PCR以单管扩增为好的问题已经讨论过，可搜索了半天楞是没找到，急！能否请各位老师从理论到操作所需注意的事项详细的讲一下？比如说是否单管扩增就一定要目的基因和内对照的循环数相同？要是分管扩增真的更好那反而好办了，因为在操作上，同管扩增的条件往往要比单管扩增来的难。
           
  ......
  
  =======================================================================
  
  我的观点：１。对照和目的基因分别作。但同管做不是不可容许
                    ２。 无论那样，一定控制在平台期之前停止，15-20cycles.不要等到平台期。
                    3.这种方法是不准确的，重复性较差。
     
  cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=24782&h=1&bpg=2&age=0')
  您找的帖在在这里／

• yonger (2015-7-02 16:36:20)

  
  谢谢两位的指导！
  先使目的基因扩增10-15个循环后,再加入内参基因,继续扩15个循环，我们对于这样的操作没有经验，特别当我们做起组织来往往标本很多，一旦半途开盖肯定会手忙脚乱，搞不好“画虎不成反类犬”，有的组织很珍贵，不能轻易冒险。
  同管扩增的话引物间竞争有时很厉害，我师弟做的PCR，目的基因和内对照在分管时扩增30个cycles条带都很亮，今天同管一扩，目的基因就很弱了，这是不是影响定量呢？
  因此分管扩增可能是更好的办法，尽管不同管之间还是存在误差的。关键还是摸平台期，这里有一个问题，比如说一个PCR程序：
  95度——5分钟；94度1分钟，60度1分钟，72度1分钟，从20-38个cycles；72度延伸7分钟。
  那么摸平台期时我共应该做7管不同的PCR（相隔3个cycles)，而后扫胶比较辉度，那么每管都要在PCR结束前72度延伸7分钟，这最后的延伸是否影响到扩增的量呢？那么对平台期曲线时是否也有影响呢？这也很烦的，能否再请诸位指教一下呢？
  多谢！

• 园丁## (2015-7-02 16:36:49)

  定量，无论同管还是分管，应该在线性区吧。
  生物曲线多是自然曲线呈S型，PCR亦然，
  在指数期内的部分可以近似认为呈线性关系，
  故可以用来定量，
  这是几乎是所有生化定量的基础，
  包括ELISA，放免，代谢动力学，热力学分析等，
  PCR也是如此，不要等到了平台期，那误差就太大了。
  因为到了平台期，PCR产物的量和初始模板的量不成正比例相关。
  在平台期模板多１０倍，产物应该差不多，
  随手画个自然曲线，马上就明白了。
  之所以要分管作，就是保持这个自然曲线的”自然性“，
  在同管竞争的条件下，自然曲线的形状都不能保证，
  怎么保证中间对时期接近直线，
  定量的基础没了，还订什么量呀？