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【讨论帖】蛋白芯片制作与应用
建立此帖目的是给大家提供一个蛋白芯片制备和应用方面的交流平台，有相关问题请在此发言：【讨论帖】蛋白芯片制作与应用
愿在此就蛋白芯片的任何问题与大家交流分享，共同提高。
[ 本帖最后由 NBA 于 2013-4-20 14:40 编辑 ]
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【讨论帖】蛋白芯片制作与应用
【讨论帖】蛋白芯片制作与应用
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-4-20 14:35 作者: NBA 来源: 分析测试百科网
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summerxx (2013-4-20 14:37:09)
NBA (2013-4-20 14:37:40)
QUOTE:
1）与DNA芯片不同，蛋白芯片不能直接在原位合成，而只能采用点样或喷墨方法制作。2）制作蛋白芯片最大的难题在于如何将蛋白与基底材料有效结合的同时，仍能保持其原有的生物活性（免疫原性、抗体特异性）不变。
3）可用于蛋白芯片的基底材料有很多种，其选择的基本要求为：①靶标蛋白以某种共价键或稳定的非共价键形式与基底表面连接；②其它蛋白、配体或小分子物质能够特异性地与所固定的蛋白发生反应；③非特异性吸附低；④稳定性好，有较长的保存期。
4）目前常用的基底材料有：硅片 、聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜、NC膜、载玻片等，也有人使用CD盘作为基质材料。
5）最常用的还是载玻片，其中又有醛基化、巯基化、氨基化或环氧基等不同活化处理。
[ 本帖最后由 NBA 于 2013-4-20 14:39 编辑 ]
NBA (2013-4-20 14:38:55)
1）载玻片是最最常用的蛋白质芯片的基质材料，但是要事先经过一定的化学处理。
2）Genometrix公司的Mendoza等人采用的载玻片处理方法是先用化学试剂氨丙基三甲氧基硅烷（Aminopropyltrimethoxysilane，APTES）（5％的乙醇溶液）浸泡洁净的载玻片10分钟，进行硅烷化反应，再用化学试剂进行进一步的处理，从而便于与蛋白质结合（Mendoza et al，1999）。
3）Harvard大学的MaBeath采用的则是另外一种方法，他们直接采用了美国TeleChem公司的SuperAldehyde载玻片。这种玻璃片是表面带有醛基修饰的载玻片。蛋白质N端的氨基或是其中赖氨酸所带的氨基可以和载玻片表面的醛基发生共价结合，形成希夫（Schiff）碱结构。也可以先在洁净的载玻片表面覆盖一层BSA分子，再用化学试剂对BSA进行活化。这样BSA中被活化的赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和谷氨酸（Glu）残基可以和点到载玻片上的蛋白质发生氨基偶联或是形成脲的结构。但是这种共价连接方式可能会使得固定于载玻片表面的蛋白质不能保持原始的稳定构象，从而失活。而研究表明，由于蛋白质分子与载玻片表面的连接总是通过少数几个这样的共价键形式实现的，反而有利于蛋白质以各种可能的方式展现在载玻片的表面（MacBeath et al，2000）。
4）Yale大学的Synder实验室的Zhu等人制作的世界首张酵母全蛋白组芯片也是使用载玻片为芯片的基底。他们使用高效表达载体表达并且纯化出大约5800种酵母的蛋白，由于表达出的蛋白质都带有His tag，所以他们在玻片表面使用Ni2+进行修饰，通过亲和吸附固定蛋白质分子（Zhu et al.,2001）。
NBA (2013-4-20 14:39:22)
简单介绍一下蛋白质芯片的知识
研究蛋白质芯片的意义
1 。蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物质层面；
2 。探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理，甚至可直接利用 生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；
3 。适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；
4 。有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。
蛋白质芯片的分类：
1，蛋白质检测芯片
2， 蛋白质功能芯片
蛋白质芯片的制备：
1。固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）
2。蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解
3。点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等
4。膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h
载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白
5。微阵列的封闭固定微阵列上的蛋白样点
主要封闭试剂：BSA或Gly
kuaizige (2013-4-20 14:40:34)
2 结合在基质上的蛋白对蛋白的纯度有什么要求？
NBA (2013-4-20 14:41:13)
QUOTE:
相关疾病：
乙型肝炎
你的问题只有通过文献回答较好。
1）在研究用蛋白芯片中，很多蛋白都是实验室自己纯化的，如以下3篇巨著：Ptacek J, Nature. 2005 Dec 1;438(7068):679-84.
Hall DA, Regulation of gene expression by a metabolic enzyme.
Science. 2004 Oct 15;306(5695):482-4.
Zhu H,Analysis of yeast protein kinases using protein chips.
Nat Genet. 2000 Nov;26(3):283-9.在偏重于临床诊断蛋白芯片中，很多蛋白可以商品化购买，比较大的可以提供人源蛋白的公司有Abnova和Genecopoeia。当然象国内喜欢做的乙肝、病毒、肿瘤标志物等，完全可以自己纯化（注意一点，国内肿瘤标志物自制成功例不多）。
2）结合在基质上的蛋白纯度要根据你使用的基质决定，不同的选材和表面衍生化处理对蛋白纯度要求不一。常规用的玻片对蛋白纯度总体要求不高
00无名指00 (2013-4-20 14:42:37)
NBA (2013-4-20 14:43:20)
NBA (2013-4-20 14:44:24)
QUOTE:
1）理论上完全可行，对几十到几百个这个范围的目标蛋白质而言，正是芯片发挥长处的地方，常规的酶免方法对同时研究30个差异蛋白而言往往力不从心。2）为了检测这些蛋白在疾病变化过程中的表达变化情况，你需要用相应的抗体来制作芯片。
3）使用MALDI－TOF也可以达到类似实验要求。
00无名指00 (2013-4-20 14:44:51)
谢谢大虾！可能是我说的不够详细。
我做临床外科的，主要是晚上上网。
现在急着开题（postdoctor）。需要完成的课题是：明确差异蛋白（这些蛋白在博士阶段，用2-D和MALDI－TOF找到的，文章已发）的临床诊断（需要较大规模数量标本）意义。下面是我的想法：
1）以往的思路是，在100份标本上，一个一个做免疫组化（有报道，可以两个联合做的）。大约30*100=3000份。试剂费用1500*30约50K，就是不完成临床工作，体力也不济。
2）用抗体芯片来做，30个抗体，100张芯片，不知道费用多少。估计远远不止50K。财力不够！且好象还不能反映出蛋白在组织的定位。
3）倒是这课题完成后，我觉得有可能开发临床诊断芯片。
4）准备用组织芯片做，减少劳动强度。
都是开题把人逼急了，恳请赐教！还在为开题发晕。。。。
JK.jon (2013-4-20 14:46:21)
目前只能做固态芯片检测，不能制作固态芯片，准备制作液态芯片！
大师看可行吗？
液态芯片原理
编码微球：分别用不同配比的两种荧光染料将直径5.6μm的聚苯乙烯微球（Beads）染成不同的荧光色，从而获得多达100种经荧光编码的微球。
交联探针、抗体或抗原：把针对不同检测物的核酸探针、抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的微球上。
检测反应：先把针对不同检测物的、用不同荧光色编码的微球混合，再加入被检测物（可以是血清中的抗原、抗体或酶等，也可以是PCR产物）。 悬液中的微球与被检测物特异性结合，结合物被标记上荧光物质。
激光分析：微球成单列通过两束激光，一束判定微球的荧光编码；另一束测定微球上的报告分子的荧光强度。
eric930 (2013-4-20 14:47:11)
请问:内皮细胞的基因芯片、蛋白芯片目前有无商品化，能够买到吗？我想从事这方面的研究，谢谢！
NBA (2013-4-20 14:48:02)
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1）内皮细胞专一的基因芯片和蛋白芯片目前都没有商品化。
2）如果做核酸类研究，可以选择相应物种的全基因组基因芯片进行代替，如果要做蛋白类研究，只能先做内皮细胞的2Dgel，然后选择靶蛋白进一步实验。
3）可供选择的模式物种为人、小鼠、大鼠、线虫、家蚕。
NBA (2013-4-20 14:48:32)
大师看可行吗？
液态芯片原理
编码微球：分别用不同配比的两种荧光染料将直径5.6μm的聚苯乙烯微球（Beads）染成不同的荧光色，从而获得多达100种经荧光编码的微球。
交联探针、抗体或抗原：把针对不同检测物的核酸探针、抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的微球上。
检测反应：先把针对不同检测物的、用不同荧光色编码的微球混合，再加入被检测物（可以是血清中的抗原、抗体或酶等，也可以是PCR产物）。 悬液中的微球与被检测物特异性结合，结合物被标记上荧光物质。
激光分析：微球成单列通过两束激光，一束判定微球的荧光编码；另一束测定微球上的报告分子的荧光强度。
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相关疾病：
肿瘤
1）液态芯片目前仍然处于基础研究方面，虽然已经有部分临床研究，但可能离大规模应用还有一段距离。
2）常见的应用如肿瘤、内分泌、自身免疫等的检测，也有人将其用于细胞因子谱判断。
3）下面是一些液态芯片相关经典的文献，有时间参考一下
1. Hany Ezzeldin, Yoshihiro Okamoto, Martin R. Johnson, et al. A High-qhroughput Denaturing High - Performance Liquid Chromatography Method for the Identification of Variant Alleles Associated with Dihydropyrimidine Dehydrogenase Deficiency. Analytical Biochemistry,2002,306:63 - 73..
2. Carson RT, Vignali DA. Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J Immunol Methods, 1999,30.227(1 -2) :41 -52..
3. Karlar,G. A, M. Jeddi-Tehrani, F. Shokri. Diminished Thl and Th2 cytokine production in healthy adult nonresponders to recombinant hepatitis B vaccine. Scand. J Immunol,2002 ,55 :311-314..
4. Taylor JD,Briley D ,Nguyen Q,et al. Flow cytometric platform for high throughput single nucleotide polymorphism analysis. Biotechniques,2001.30 ( 3 ) ,661 - 666.668 - 669..
5. Wilco de Jager, Henk te Velthuis, Berent J. Prakken, et al. Simultaneous Detection of 15 Human Cytokines in a Single Sample of Stimulated Peripheral Blood Mononuclear Ceils. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology,2003,10( 1 ) :133-139..
6. lannone MA.Microsphere-htsed molecular cytometry. Clin Lab Med,2001.21 (4) :731 -742..
7. Joos TO, Stoll D, Tempiin MF. Miniaturised multiplexed immunoassays. Curr Opin Chem Biol,2002,6( 1 ) :76 -80..
8. Dunbar SA, Vander zee CA, Oliver KG, et al. Quantitative, multiplexed detection of bacterial pathogens : DNA and protein applications of the Luminex Lab MAP system. J Microbiol Methods,2003,53 (2) :245 - 252..
9. David Opalka, Charles E. Lachman, Stefani A. MacMullen, et al. Simuhaneous Quantitation of Antibodies to Neutralizing Epitopes on Virus-Like Particles for Human Papillomavirus Types 6,11,16, and 18 by a Multiplexed Luminex Assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology,2003,10( 1 ) :108-115..
NBA (2013-4-20 14:49:01)
我做临床外科的，主要是晚上上网。
现在急着开题（postdoctor）。需要完成的课题是：明确差异蛋白（这些蛋白在博士阶段，用2-D和MALDI－TOF找到的，文章已发）的临床诊断（需要较大规模数量标本）意义。下面是我的想法：
1）以往的思路是，在100份标本上，一个一个做免疫组化（有报道，可以两个联合做的）。大约30*100=3000份。试剂费用1500*30约50K，就是不完成临床工作，体力也不济。
2）用抗体芯片来做，30个抗体，100张芯片，不知道费用多少。估计远远不止50K。财力不够！且好象还不能反映出蛋白在组织的定位。
3）倒是这课题完成后，我觉得有可能开发临床诊断芯片。
4）准备用组织芯片做，减少劳动强度。
都是开题把人逼急了，恳请赐教！还在为开题发晕。。。。
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知道你要做什么就好更有针对性的帮你了。
1）前提：这30个蛋白你手里应该已经有了。
2）临床检测有2种，一种是血清学指标，一种是组织形态学指标，因此请首先做预实验确认这点，如果兼或有之，对一个博后课题而言，选择其一进行即可，不可能面面俱到。
3）如果是血清学检测，则选择蛋白芯片较好。
4）如果是形态学观察，可以用组织芯片。
5）无论使用哪种芯片，都需要得到这30个蛋白的抗体，按照你文中的经费是不太够用，对那些有商品化的，尽量选择小包装抗体，全新蛋白，建议你还是放弃吧，否则制备抗体投入太大，即使做多抗也需要2－3个月，还需要K以上经费。
6）得到抗体后，做蛋白芯片其实很简单，自己在PVDF等膜上点样即可，成本很低。
7）至于检测芯片倒是有可能在你课题进行当中获得启示和灵感。
8）组织芯片是个很好的工具，的确可以大大减少劳动强度。
XYZQ (2013-4-20 14:49:27)
1.前面几届没有在血清中找到有实际意义的差异蛋白.故血清学检测放弃.
2.已经设计用组织芯片技术来做免疫组化检测.
3.预计结果是几个蛋白联合才能反映该疾病的发生\复发趋势.
4.后期工作可能是要做蛋白检测芯片.到时候请赐教!愿意合作也可以,我们有临床基地,标本也绝对不愁.
u234 (2013-4-20 14:50:05)
请大师就目前蛋白芯片的实际应用方面发表高见！呵呵！目前我就知道价格高！昨天询价，每片需要6000人民币左右！天价啊！！
memory (2013-4-20 14:51:08)
刚接触蛋白芯片，有个问题想请教老师，我已经用seldi分析了两组疾病，目的是要找到有差异的蛋白，现在我已经找到了几个处蛋白有差异显著性。可是我希望还能往下做，找到其中的蛋白具体是什么。但查了文献，好像目前做seldi分析血清的都是只做到找出差异蛋白为止。
希望老师可以给我建议。
NBA (2013-4-20 14:51:37)
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1）总体而言，蛋白芯片还是一个处于发育期的事物，尽管有着很光明的前景，但路还要一点点去走。芯片目前仍然是阳春白雪，离老百姓的实际生活应用还有一段距离。现在的芯片主要还是科研用途，实际上在这方面，蛋白芯片已经和正在显示其卓越的特质，发挥了很大作用。
2）国内是喜欢做一些检测应用，如肿瘤标志物C12系列和肝炎检测、自身免疫检测等，总体而言，这些项目的前景还是可以看好的。
3）由于目前该领域门槛较高，竞争不激烈，高价是市场化不完善的必然后果。如果只是做实验，个人认为lzsgxl兄完全可以自己做芯片，不用买商品化的。
NBA (2013-4-20 15:00:28)
希望老师可以给我建议。
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1）我没有qq，如有问题，欢迎来此交流，我会经常来此回帖。
2）SELDI技术是2002年诺贝尔化学奖的应用技术，目前其应用研究成果发表在Nature、Science、Lancet等30余种著名杂志上。
3）该技术特点在于高灵敏度、高准确性，能从一个不同成分的混合体系中检查和区分不同组分、不同分子量，差别在1~2个氨基酸即可区分。
4）该技术只能提供差异，即指纹图谱。
5）如果需要进一步研究，仍然需要用常规方法，如测序、展示或酵母杂交等。
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