【求助】帮我分析下原因

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• hold住 (2014-6-18 17:29:03)

  
  建议,供参考!
  1.楼主的扫描仪有没有问题.怎么左边的颜色深,右边浅啊?界限很明显
  2.琼脂糖的质量有问题没?琼脂糖的质量能影响到胶的背景,我原来用的是Sigma的低熔点琼脂糖,效果不错.
  3.电压上不去一般是因为盐离子浓度过高,去盐.
  4.楼主的2-D图谱上的斑点有些垂直拖尾,可能原因以及解决方案:
  蛋白没有被SDS 充分包裹,平衡缓冲液SDS 浓度>1%，平衡2 x 15分钟.
  部分自由的巯基再次氧化生成二硫键聚合物,平衡缓冲液中加入充足的DTT, 使蛋白烷基化.
  蛋白发生氨甲酰化,含有尿素的溶液加热温度不能超过37°C.   
  5.建议楼主不要单独用丙酮处理样品,而是TCA-丙酮处理.
  个人认为楼主的2-D图谱还可以了.
  楼主好运!

• cj_mondy (2014-6-18 17:29:23)

  
  谢谢！！！
  1. 胶上颜色左右两边确实有分界，因为IEF结束时，在胶的中间偏酸性端有一个鼓包，很明显的凸起，鼓包的位置就在图上分界线处，应该与这有关系。不知道为什么，IEF总是出现胶中间鼓包的现象，别人有遇到么？有什么解决的办法？
  2. 琼脂糖的问题我倒是没有考虑到，会不会跟上槽缓冲液污染有关呢？
  3. 我今天用TCA-丙酮沉淀处理样品，可是沉淀了8个小时，看不到任何的沉淀，但我单独加丙酮却能很明显的看到沉淀出现。我用的是含10%TCA和20mMDTT的冷丙酮，TCA购买时间很长了，跟这有关么？

• jrwyyplt (2014-6-18 17:29:44)

  
  1.个人认为跑得不错!
  2.楼主用的什么银染方法,我的感觉是银染问题,似乎不均匀.银染过程要均匀摇晃胶,显色要及时终止.
  3.鼓包要检查槽子是否不平,导致气泡产生.
  4.个人认为丙酮沉淀比TCA-丙酮沉淀处理组织样品好.

• cj_mondy (2014-6-18 17:30:00)

  
  我觉的不是染色的问题，今天我们实验室的一个老师做银染，也出现相同的情况。
  丙酮沉淀用什么复溶效果好呢？

• hold住 (2014-6-18 17:30:26)

  谢谢！！！
  1. 胶上颜色左右两边确实有分界，因为IEF结束时，在胶的中间偏酸性端有一个鼓包，很明显的凸起，鼓包的位置就在图上分界线处，应该与这有关系。不知道为什么，IEF总是出现胶中间鼓包的现象，别人有遇到么？有什么解决的办法？
  2. 琼脂糖的问题我倒是没有考虑到，会不会跟上槽缓冲液污染有关呢？
  3. 我今天用TCA-丙酮沉淀处理样品，可是沉淀了8个小时，看不到任何的沉淀，但我单独加丙酮却能很明显的看到沉淀出现。我用的是含10%TCA和20mMDTT的冷丙酮，TCA购买时间很长了，跟这有关么？
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  胶的中间偏酸性端有一个鼓包，很明显的凸起，我想大概有两个原因:
  1.水化不均匀,加完样品,放置胶条后,再轻轻提起胶条,然后慢慢放下,重复两三次,保证槽子里的样品分布均匀,再仔细检查一下,如果发现胶条的某一段样品浸润不够,用干净的枪头拨匀,加覆盖油也要尽量均匀.
  2.胶条有问题,按照楼主的说话,这种可能性很大,我也遇到过,那就只能换胶条了,没有别的办法.
  另外楼主说丙酮处理后的样品用什么复溶,我用的是裂解液或水化液!
  楼主好运!

• cj_mondy (2014-6-18 17:30:44)

  
  我用的是胃组织，丙酮沉淀好还是TCA/丙酮沉淀蛋白质好呢？
  GE的clean-up kit 有人用过么？效果如何？
  PIERCE的2D sample pre for soluble or insoluble proteins 试剂盒脱盐效果如何？
  丙酮沉淀后我用裂解液复溶，不能完全溶解沉淀，有什么特别需要注意的么？

• mod=8048 (2014-6-18 17:31:00)

  
  上半部背景深的原因可能有二：1.是上部的电泳缓冲液用太久了最好每次新配；2.是琼脂糖凝胶最好能用滤纸过滤一下这样基本上就能解决上半部背景问题了我以前的胶也出现过这样的情况。

• cj_mondy (2014-6-18 17:31:26)

  谢谢大家，我把电泳缓冲液重新配了，跑得胶已经没有上半部背景深的问题，可是又出现新的情况了，请大家帮我分析下。
  但是电压这次很容易上到8000V，是不是电压达到8000，就说明样品里的盐离子含量不高呢？

  
  56717483.snap.jpg

• orangecake (2014-6-18 17:36:08)

  
  你的电压上去了，也要看电流的大小，如果电流一直很高，也说明盐浓度也较高。

• cj_mondy (2014-6-18 17:36:24)

  我的电流是58uA，我设定的电流是60uA，这个电流是不是很大？

• cj_mondy (2014-6-18 17:37:07)

  我感觉蛋白质沉淀，我的裂解液里有硫脲，而水化液里没有，膜蛋白在水化液里会溶解性降低，沉淀下来，导致点分不开，是这样么？

• bamboo16 (2014-6-18 17:37:25)

  
  个人觉得你的蛋白溶解的不是很好，同时胶条和二维的sds胶接触不良