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新一代测序在农业领域大放光彩

2015.11.26

　　普通农夫的谷仓里肯定没有最新款的HiSeq测序系统。不过，这并不意味着新一代测序（NGS）在农业领域就不如医学领域那么重要。

　　乔治亚大学的特聘教授Andrew Paterson就利用NGS来捕获群体的多样性，他将基因型与参考基因组进行比较。他领导的植物基因组作图实验室也利用NGS从不同个体中获得许许多多的许可，“这样我们可以了解谁和谁关系比较近”。

　　不管是研究玉米，还是研究小鼠，传统的遗传学、分子生物学和生物化学、生物信息学以及其他学科中的许多技术都是一样的。然而，植物为研究人员带来了一些独特的挑战和机遇。

　　多倍体

　　植物可能携带了基因组的多个拷贝，比如说，面包小麦是六倍体，而甘蔗的拷贝数多达200个。“即使是四倍体，我们都很少有高质量的参考序列，更不用说六倍体了，”HudsonAlpha生物技术研究所的Jeremy Schmutz谈道。诚然，亚基因组之间有足够的差异，让你将大多数基因与每条染色体的不同特点相关联，但并非全部。Schmutz说，有很多东西，你无法说出它们从哪里来，到哪里去，因为有太多的拷贝。甘蔗就更不用说了。

　　通常情况下，人们对亲本或祖先种或者模式生物开展遗传学和基因组学分析。短柄草（Brachypodium）的基因组就特别小；它常作为小麦或其他草类的替身。“重测序小麦可能需要Illumina HiSeq X Ten的半个流动槽，这相当于5个人类基因组。而短柄草只有350 Mb，因此你可以尽情测序，”Schmutz说。你可以诱导突变，测定表型，如果你发现了一些有趣的，可以看看小麦中的相同基因做了什么。

　　参考呢

　　目前最优质的植物基因组是水稻基因组，这主要是因为“我们使用了非常非常小心的BAC-by-BAC方法。我们利用Sanger测序对每个BAC（细菌人工染色体）进行单独测序，”亚利桑那基因组研究所的Rod Wing教授谈道。这个基因组于2005年发表。

　　Wing还参与了玉米基因组的测序，这也是通过BAC-by-BAC开展的。不过那时，“我们没有足够的资金来完成每个BAC，因此唯一完成的是真正的基因部分，”Wing解释道。最近，人们利用短读取技术测序了基因组，产生了缺乏大部分非编码区域的基因组组装。

　　NGS的最大问题之一是短读取无法很好地对付重复片段，这可能占了基因组的一半。现在有一种技术能够很好地应对，南伊利诺伊大学的David Lightfoot教授谈道，那就是PacBio的长读取技术，它往往能够跨过重复区域。Lightfoot的研究团队正准备发表橄榄树基因组，这就是结合短读取和长读取测序的。

　　高分子量DNA

　　BAC、长读取测序、matepair文库构建，以及其他一些方法，都需要相对高分子量的DNA。“对于血液样本而言，这很容易获得，但是对植物来说有点难，因为它们积累了碳水化合物以及其他的代谢产物，可能降解DNA，”Schmutz说。此外，叶绿体可能贡献了10% 的DNA。最好去除它们，“这样你就不会一而再、再而三地把钱浪费在叶绿体的重测序上，”Lightfoot说。他使用了各种方法，包括在黑暗中育苗（这也能去除淀粉），从根部取样，或者使用现成的试剂盒来分离细胞核。

　　Wing的团队不依赖试剂盒，而是裂解并离心细胞，然后用温和的去污剂（如Triton™ X100）重悬沉淀，裂解叶绿体和线粒体，但保持细胞核完整。“然后你就可以取出细胞核，纯化出高分子量的DNA，用于PacBio或长读取测序，”他说。为了制备BAC文库，他的团队将DNA嵌入低熔点琼脂糖中，创造出DNA多孔袋，让纯化DNA的酶和试剂可在其中扩散。DNA则永远不会受到任何剪切力。

　　新应用

　　目前，植物基因组学中的大部分经费都用来生成参考基因组。下一步是寻找作物的多样性，并查看它们的野生亲缘种。“在驯化过程中，你可能经历了消除所有变异的过程，不过事实证明，这种变异有望解决许多的农业问题，”Wing说。密歇根州立大学的Rebecca Grumet教授及其团队正在寻找葫芦科的抗病遗传标记（QTL），特别是西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜，这最终将帮助育种者轻松筛查抗病品种。遗传标记能帮助育种者混合多个性状，抵抗多种疾病，还能带来其他的优良性状。

　　她的团队是利用两种测序法基因分型（GBS）来实现的。第一种是基于双亲交配：将抗病株与敏感株杂交，查看后代。它们都有全基因组参考序列，因此能够找出性状所在的位置。第二种是GWAS：他们计划对每种作物的1000个种质资源进行测序，特别是它起源的区域。他们将利用这些信息来了解多少遗传多样性是来自那里，并建立核心种质。

　　此外，许多其他的NGS技术，比如RNASeq，也将在植物学研究中大显身手。如今测序已经扎下了根，而随着成本继续下降，新一代的研究人员更加熟练，它的应用必将开花结果。

测序系统

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