【求助】Western检测TNFa、TGFb的问题

最新回复

• popo520 (2013-5-30 17:02:45)

  一抗有可能没有问题；转膜也没有问题！建议楼主考虑一些蛋白提取的问题，有可能根本没有提到你想要得蛋白！祝成功！

• damingxia0904 (2013-5-30 17:03:08)

  楼上您好！能详细说说吗？actin都提到了，我还检测过别的20kDa的蛋白，也能检测到。为什么就没有TNFa和TGFb？提取这两个蛋白需要注意什么问题？谢谢！

• popo520 (2013-5-30 17:03:27)

  
  这两个蛋白是膜蛋白吗？如果没有记错，他们似乎是在膜上表达？如果是膜蛋白，国内没有可以提膜蛋白的试剂盒，建议你选用pierce的专用膜蛋白提取试剂盒，价格比较高，可能要2500元，祝好运！

• damingxia0904 (2013-5-30 17:03:45)

  
  相关疾病：
  骨折心力衰竭
  你好，TNFa和TGFb均属于细胞因子/生长因子，是分泌表达的，而不是膜蛋白。
  
  转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β。在体外，非活性状态的TGF-β又称为latency associated peptide（LAP），通过酸外一时可被活化。在体内，酸性环境可存在于骨折附近和正在愈合的伤口。蛋白本科的裂解作用可使TGF-β复合体变为活化TGF-β。TGF-β是由两个结构相同或相近的、分子量的12.5kDa亚单位借二硫键连接的双体。人TGF-βcDNA序列研究表明，单体的TGF-β112氨基酸残基是由含400氨基酸残基的前体份子（per-pro-TGF-β)从羧基端裂解而来。pre-pro-TGF-βN端含有一个信号肽，在分泌前被裂解掉，成为非活性状态的多肽链前体（pro-TGF-β)，通过改变离子强度、酸化或蛋白酶水解切除掉，成为非活性状态的多肽链前体（pro-TGF-β)，通过改变离子强度、酸化或蛋白酶水解切除N端部分氨基酸残基，所剩余的羧基端部分形成有活性的TGF-β。TGF-β1与TGF-β2有71%氨基酸同源性，TGF-β1与TGF-β3有77%同源性，TGF-β2与TGF-β3有80%同源性。
  
  TNF-α又称恶液质素，是由激活的单核/巨噬细胞分泌的一种具有多种生物活性的细胞因子，与受体结合能产生多种生物效应，如免疫刺激、调节机体的抗菌作用、蛋白激酶C的激活和涉及多种炎症、细胞生长的基因表达的激活.TNF-α可分为跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α，主要由激活的单核/巨噬细胞产生，活化的T细胞、NK细胞和肥大细胞也可产生、分泌TNF-α，心肌细胞等多种非免疫细胞在某些应激状态下（如心力衰竭）也具有产生TNF-α的能力，目前认为心、肝、肺、肾是TNF－α生物合成的主要器官。跨膜型TNF-α的一级结构有233个氨基酸残基，-76～-1位为引导肽序列，该序列中-1～-70位连接段，-21～-46位是疏水区域，可形成跨膜段，其余部分为胞内段。在金属蛋白酶TACE作用下，跨膜型TNF-α胞外段1～157位可被水解，脱落为分泌型的TNF-α，分泌型TNF-α释放入血发挥作用.TNF-α的生物学功能是通过细胞表面的相应受体介导来实现的。TNF-α受体分两型，即TNFR1和TNFR2，他们同属于一个受体超家族，即TNF受体超家族。TNFR1和TNFR2的细胞外部分则由182个和235个氨基酸残基构成，两者都由具有高度序列同源性的半胱氨酸结构构成，但是在细胞内的结构域却未显示出序列的同源性，提示两种受体激活有着不同的细胞内径路。不同细胞每种受体作用还未明确，但大多数人认为TNF-α的大部分生物活性是由TNFR1所介导，包括细胞毒性、纤维细胞增殖、抗菌、前列腺素E的合成、抗病毒和超氧化物歧化酶的诱导，而TNFR2主要介导T细胞的增殖、皮肤坏死、胰岛素抵抗等。

• qqq111 (2013-5-30 17:04:04)

  
  刚刚接触TGF，课题设计中，想做药物干预后，肝脏内TGF及其受体的量有无改变，不知道楼主能否给予指导，谢谢！

• windy+++ (2013-5-30 17:05:41)

  
  is your TNFa a mouse TNF? another thing is how is your dilution? seems this paper
  J Virol. 2005 December; 79(24): 15405–15416
  (polyclonal goat antibodies that recognize murine TNF-α (sc-1350, diluted 1:500 [Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA], )
  can tell you something.
  did you use anti-goat secondary antiobody?

• damingxia0904 (2013-5-30 17:06:08)

  我的western TGF一直做不出来，正在想办法解决，等解决了之后再给你建议吧。

• damingxia0904 (2013-5-30 17:14:37)

  这篇文章我看了，他们没做western，做的是免疫染色。我们用的二抗是Zymed的HRP-兔抗羊二抗，没有错。。。还是谢谢你！

• tangxin_80 (2013-5-30 17:25:53)

  
  你的actin做出来效果怎样，如果是非常浓，或者说你改进了条件，做出来的actin一般浓。总之如果actin是非常容易做出来，而且量很高，说明你提蛋白应该没有问题。可以考虑抗体的问题。直接去公司质询，国外公司的抗体有问题是非常正常的。
  如果你的actin是勉强做出来的，条带很淡、或扩散严重。那么就要仔细考虑western的整个步骤，做实验中的每一步都有可能出问题。最主要的是提高上样量。因为actin能做出来，大致的实验步骤应该没有问题。
  因为actin是非常好做的蛋白，所以actin 做出来，能说明的问题其实非常有限。另外，你做的两种都是分泌蛋白，不知道做的是组织还是细胞，可能提取的方法是不一样的。呵呵！

• yes4 (2013-5-30 17:34:51)

  
  TNFa、TGFb的种属来源是什么啊？？

• flower-201 (2013-5-30 17:35:49)

  我做的是细胞,用蛋白裂解液提取的蛋白,也是TGFb,一直没有做出来，内参条带很浓，不知是怎么回事

• loli (2013-5-30 17:36:48)

  请问楼上的你做的细胞什么种属来源的？我要做人的TGF-beta1，但是不不知道蛋白的分子量，请问下怎么查？谢谢

• youyou99 (2013-5-30 17:37:20)

  我做的是大鼠来源的.我也没查,是师兄以前做过的,说是25KD,我又问了其他人,说有三种形式,单体12.5KD,二聚体25KD,前体是50KD左右.人的可能也差不多吧,具体的你买抗体的说明书上有是哪一种的

• PCR (2013-5-30 17:39:01)

  
  同感啊。
  我也是啊，抗体用的也是santa cruz的，而且我都做了差不多10次了，就是做不出TNF alpha，内参和别的抗体做的都还凑合，TNF就是不出，老板逼得我都要跳楼了，他强烈要求我做出来。
  
  哪位达人能救救小弟一把啊？救人一命胜造七级浮屠啊。阿门！！

• PCR (2013-5-30 17:39:39)

  忘了，我的一抗都1：50稀释了，二抗都1：100了，我晕，TNF，I服YOU.

• avi317 (2013-5-30 17:39:59)

  
  既然TNF、TGF是分泌蛋白，
  
  对于培养细胞的蛋白， 是否需要试试细胞培养液呢？是否可以使用ELISA代替以提高灵敏度呢？是否需要浓缩，以提高这两种蛋白的浓度？或者需要加入蛋白酶抑制剂？
  
  对于组织提取的蛋白，我没有经验。只能瞎说两句。既然别人用免疫组化能做出来，我想WB也应该能作出来吧。但是这两个蛋白/多肽在你要提取的组织表达丰富吗？

• 33号 (2013-5-30 17:40:39)

  
  你是从哪种组织或细胞中提取的蛋白？这2种蛋白的丰度如何？
  据我所知，TNFa在某些诱导因素下，才能表达增加，而基础表达可能不高。
  你是否可以做一个阳性对照，以检测你的抗体是否有效。

• fsdd817 (2013-5-30 17:41:52)

  
  公司的网页暂时有点问题，我把我们做的TGF beta1传下来，供大家看一下。
  我们做了两个，一个是通过表达蛋白做的：ReSRP0050
  另一个是合成多肽做的。SRP00793
  
  [ 本帖最后由 fsdd817 于 2013-5-30 17:46 编辑 ]

  
  68029742.jpg

• remenb (2013-5-30 17:46:37)

  "我要做人的TGF-beta1，但是不不知道蛋白的分子量，请问下怎么查？谢谢"
  可以到抗体的公司网站上查，输入TGF-beta1，就可以看到很多种相关抗体，点击抗体，就有抗体的介绍，图片，大小，和推荐的阳性对照。
  我的santa cruz抗体可以在其网站上查到。其他的公司还没验证过。
  
  关于akanggg的问题，还有一个解决办法是，检测该公司推荐的阳性对照细胞的TNF，看是不是抗体的问题。
  谢谢！

• idea2011 (2013-5-30 17:47:11)

  您好。
  不是其他的公司都没验证过，我们公司的TGF-beta 1已经验证过。有其他的实验室也买过，效果很好。