【讨论帖】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ...

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• loli (2013-10-17 17:43:35)

  抗体问题排在第一，抗体的特异性，一抗二抗的比例，这些都需要摸索条件。
  蛋白电泳第二，胶的配置，由于APS的失效，tris-Hcl PH不准，丙烯酰胺的氧化（以上问题一般都是配置时间较久以后）导致电泳失败或泳道奇形怪状。

• uuooii (2013-10-17 17:43:53)

  
  我认为western bloting 中蛋白提取是关键，最好用试剂盒提取，尤其目的蛋白是在亚细胞器表达的蛋白；其次是一抗二抗，一抗最好单克隆抗体，二抗国产好厂家的也行 ；ECL发光试剂一定要灵敏；制胶，电泳和转膜个实验室都做得比较常规了；显影定影按说明书作做活实验是经验就行。

• 89tongzijun (2013-10-17 17:44:30)

  
  我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。
  
  另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。
  
  最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。

• zranqi_1 (2013-10-17 17:44:52)

  我以前做的时候问题主要出现在样品的制备上，也就是如果免疫时用到的蛋白和wb时的蛋白有出入，这样就会导致wb失败，所以后来我就一次性制备足够的蛋白，可以不是很纯，但是一定要和免疫动物时候用的蛋白是同一批的。

• summerxx (2013-10-17 17:45:12)

  
  看到好几位战友都对蛋白制备有深刻的印象，也提醒我们正在WESTERN和准备WESTERN的战友，一定要注意过第一关，提出高质量的蛋白对实验成功至关重要！
  希望更多的战友参与！

• ha111 (2013-10-17 17:45:38)

  
  楼上几位战友提出的蛋白制备确实非常重要，但如果在裂解液中加入cocktail的话应该不容易降解，-80度保存几个月都没有问题。
  我认为western blotting 中最关键的一步是转膜。我的经验是小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。
  抗体一般在其他问题排除后再考虑是否有质量问题。

• moonlight45 (2013-10-17 17:46:00)

  请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）
  
  还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是什么原因？
  
  谢谢了！

• nut6694 (2013-10-17 17:46:30)

  请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）
  
  还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是什么原因？
  
  谢谢了！
  
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  战友，内参一般比较好做，能出来说明整个WB的流程应该没有问题，提的蛋白也可以，但是目的蛋白由于分子量大小不一样可能电泳和转膜条件也不一样，还有蛋白丰度问题导致蛋白量低出检测范围、抗体等环节都应该考虑。具体的问题可以把你详细的条件另辟新贴求助，祝出结果！谢谢！

• mimili_901 (2013-10-17 17:46:53)

  细节地方一定要多注意，比如SDS－PAGE时的缓冲液pH值啊，temed、ap的新鲜程度啊，样品上样前的处理啊，还有转膜时的电压/电流、膜的处理，还有ECL时的抗体孵育时的时间与温度，显影/定影啊等等。其实一般出问题很多时候都是由于在细节地方的疏忽造成的。
  希望高手继续补充细节内容：）

• am10 (2013-10-17 17:47:13)

  我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
  1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
  2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
  就这些了，请各位指正

• windy+++ (2013-10-17 17:47:43)

  我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
  1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
  2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
  就这些了，请各位指正
  
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  我的感觉是电泳跑胶时buffer的利用，如果蛋白跑出胶外，那下次一定就要更换，如果没有的话还能用一两次．

• zranqi_1 (2013-10-17 17:48:36)

  
  我是第一次作，作了3次，目前还没有成功。我发现跑胶的时候，有时候Marker会歪歪扭扭，转完膜（90V,4hr)后还有胶孔附近有残留，是不是没有转完全？另外，DAB染色和ECL那个好一点？如何操作？
  盼各位大侠给个意见。

• nut6694 (2013-10-17 17:48:53)

  
  首先确定你的胶的浓度和离子强度没问题，如果胶不均匀Marker容易跑歪。转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室仲压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。

• xue258 (2013-10-17 17:49:12)

  
  做了几个月western了，总结下本人在western中遇见的一些问题：
  
  听过一个讲座，说是在抗体中加叠氮钠，可以在4度保存，避免抗体的反复冻融。结果我就犯错误了，二抗也加叠氮钠了，导致发光显不出条带，找原因找了一周，才知道叠氮钠能抑制HRP的活性。

• S6044 (2013-10-17 17:49:39)

  
  我所纯化的蛋白为未知蛋白，目前仅知其具有甘露糖结合的活性和分子量，想用WB的方法鉴定纯化出的蛋白是否具有结合甘露糖的能力。在实验的过程中一直得不到理想的结果，有两个问题请各位高手指教：
  1、不知在SDS-PAGE和WB的条件下，蛋白的糖结合活性是否可得以保存
  2、因为蛋白是未知的，所以没有抗体可用，我们用一种带有甘露糖基的BSA来代替抗体，并用10nm胶体金与之耦联作为显色之用。10nm胶体金之前一直用于电镜观察，不知可否用于WB的显色。请各位各个意见。

• JK.jon (2013-10-17 17:49:54)

  
  我作WB，
  第一次：SDS-PAGE电泳都没跑出来，怀疑是蛋白降解了，但是后来同样的样品和别人一起又跑一次，就跑出来了，发现是配胶的问题。分离胶要用12％的。
  第二次：样品制备OK，浓度也测好了，电泳也跑得不错，PVDF膜不小心被手指划了一下，结果最后显影时候，显出来一个划痕。
  第三次：我的B-actin做出来了，但是我的目的条带怎么也不出来，同样的条件，同样的过程，试剂也一样，我师姐的就做出来了，可见不是试剂的问题，显影同样用的DAB，这次考虑是抗体的问题了。
  第四次：找公司换了抗体，果然ok了！

• eric930 (2013-10-17 17:50:21)

  本底过高：
  （1）封闭不好。
  （2） 一抗、二抗作用强度过高。
  （3） 洗涤不充分。
  对策包括：
  a. 延长封闭时间；
  b. 可调节一抗，二抗的稀释度，找到一个最佳浓度，使之能得到有效强度的信号，而非特异性的染色较低。
  c. 充分洗涤，将未结合上的非特异性的抗体洗掉，可在缓冲液中加0.02-0.2%Tween20。
  假阳性： 多数由抗体和有部分同源性的抗原间的交叉反应引起。主要解决办法是在保证阳性结果可见的前提下，尽可能高地提高抗体稀释度，使假阳性消失

• mamamiya (2013-10-17 17:51:02)

  
  我进实验室最先接触的就是WESTERN，我觉得首先要提出高质量的蛋白，然后一鼓作气往下做，不要放太久，即使－80度超过三个月结果也不太理想。新鲜的样品跑出来的条带很靓的。
  实验室的温度对制胶很重要，气温过低会使凝胶不均匀，一、二抗也孵不上去，夏天的时候，不到8个小时就可以做完一个WESTERN，现在就不行了。
  封闭液要保证有效。
  一、二抗比例要适当，不然即使高浓度也没用。
  转膜是个技术活，要耐心，但不是磨蹭。
  化学发光试剂要好。
  显影时间的控制和调整。
  另外注意一些细小问题，比如缓冲液不要加错，上样要尽快，电泳时电压不要太高，洗膜要充分等，有时候往往会犯一些及其可笑的错误。
  

• 阿k (2013-10-17 17:51:24)

  如果胶中有小的裂隙，对转膜有影响吗？

• tudou85 (2013-10-17 17:51:43)

  
  我最近一直在做，可是碰见一下问题向高手们请教，希望提点改正意见：
  1 转膜时，多次出现小分子量的转膜效果不如中分子和大分子量的（用的彩虹MARKER，但14KD的亮黄色的条带仍然在胶上，转膜后的胶染色后小分子量区域的蛋白残留较多。在整张和将不同区域的分别转膜时均出现这种情况。）
  2 在暗室里肉眼可以看见发光，可是胶片上一无所有。
  3 ECL没有表达，可是用DAB时膜上却出现条带。
  4 手工显影时，胶片的显影时间和温度有很大关系吗？显影的时间掌握如何比较恰当？